分析高效生物样品中酪氨酸及其代谢产物新技术及其运用

论文导读：
摘要：酪氨酸是人体重要的半必需氨基酸,酪氨酸血症、尿黑酸症等氨基酸代谢疾病、肝肾疾病、神经系统变性性疾病、恶性肿瘤等均可导致酪氨酸代谢异常,以而引起体液中酪氨酸及其代谢产物含量的变化。由此,探讨建立简便、快速、灵敏的浅析策略并运用于人体体液中酪氨酸及其代谢产物含量的浅析,对于某些疾病的辅助诊断、治疗和监测具有十分重要的临床作用。然而,在酪氨酸及其代谢产物的探讨中,以酪氨酸的探讨较为深入,现已成功运用于临床上氨基酸疾病的筛查,而对酪氨酸代谢产物的探讨相对较少。在已有的测定酪氨酸及其代谢产物的策略中,同时测定酪氨酸及其一种或两种代谢产物的报道较多,而同时测定多种代谢产物的报道较少。基于此,本探讨在国内外酪氨酸及其代谢产物浅析策略的基础上,探讨建立了生物样品中酪氨酸及其代谢产物浅析新策略,取得了较为满意的结果。其探讨成果如下：1.在pH=6.00的KH2PO4-NaOH缓冲溶液中,设置波长差△λ=35nm,采集260～325nm波长范围内的同步荧光光谱数据,并对该数据进行一阶求导后用偏最小二乘法处理,以此建立了偏最小二乘-导数同步荧光光谱法同时测定对羟乳酸、多巴和尿黑酸的新策略。三种物质的线性范围分别为0.06～3.00mg/L,0.06～3.00mg/L和0.08～3.00mg/L；检出限分别为0.03mg/L,0.03mg/L和0.04mg/L。此法用于细胞培养液中三组分的同时测定,结果令人满意,且其测定结果与高效液相色谱法的测定结果相比无显著性差别。2.利用酪氨酸及其代谢产物具有自体荧光的特性,建立了超高效液相色谱-荧光检测法测定人体血清中酪氨酸及其代谢产物的浅析策略。血清经高氯酸(5%,v/v)沉淀蛋白,高速离心取上清液后,过膜测定。采取ZORBAX SB-C18快速分离柱,以甲酸铵-甲酸缓冲溶液(pH=5.8)：乙腈=95：5(V：V)为流动相,调节流速为0.20mL/min,荧光检测波长为γex=277nmr,γem=316nm,待测物在10min内完成分离,且效果良好。结果显示,多巴的线性范围为0.032～2.00mg/L,酪氨酸的线性范围为0.16～20.00mg/L,对羟乳酸、对羟乙酸、酪胺和对羟丙酸的线性范围为0.016～2.00mg/L；六种待测物的检出限在0.016～0.032mg/L之间；定量限在0.040～0.080mg/L之间；线性相联系数在0.9996～1.0000之间,线性联系较好。健康人和癌症病人血清中六种待测物在三个不同加标水平下的平均回收率分别在86.5%～102.5%和88.3%～107.3%之间,相对标准偏差分别在0.3%-5.7%和0.5%～4.3%之间。以上结果表明,该策略准确可靠,可用于实际样品的测定。将所建立的策略运用于健康人、乳腺癌病人和肝癌病人血清中酪氨酸及其代谢产物的浅析,结果显示,癌症患者和健康人血清中酪氨酸及其部分代谢产物的含量有一定差别,且不同癌症患者血清中酪氨酸及其部分代谢产物的含量也有所不同。本探讨为今后深入探讨酪氨酸及其代谢产物和某些癌症的关联性打下了一定的基础。3.采取固相萃取技术,结合超高效液相色谱-荧光浅析手段,建立了人体尿液中酪氨酸、对羟乳酸和对羟乙酸同时测定新策略。系统探讨了不同机理下,运用固相萃取技术处理尿液的效果,最终选用Clean-Screen DAU混合固相萃取小柱处理尿液,成功地除去了大量干扰物质,结果令人满意。三种物质线性联系良好(R20.9996),检测限均为0.016mg/L,在三个水平的加标回收实验中,回收率在86.9%～107.9%之间,相对标准偏差小于2.8%。该策略利用酪氨酸及其代谢产物的自体荧光特性,无需衍生即可测定,策略快速、灵敏度高,选择性强,可用于人体尿液中三组分的同时测定。实验结果显示,肝癌患者或发生肝转移患者尿液中对羟乳酸和对羟乙酸的含量显著高于健康人,而其他癌症患者尿液中酪氨酸、对羟乳酸和对羟乙酸的含量与健康人相比无显著性差别。4.建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定乳腺癌患者血清中多巴、酪氨酸、对羟乳酸和酪胺的浅析策略。采取ZORBAXSB-C18快速分离柱,以甲酸铵-甲酸缓冲溶液(pH=5.8)：乙腈=95：5(V：V)为流动相,调节流速为0.20mL/min,在已优化的质谱条件下,待测物在6min内完成分离,且效果良好。结果表明,DOPA和PHPLA的线性范围为0.20～10.00mg/L,Tyr的线性范围为0.40～20.00mg/L, TA的线性范围为0.001～0.025mg/L；四种物质的检出限在0.0005～0.20mg/L之间；定量限在0.001-0.40mg/L之间；线性相联系数在0.9989～0.9997之间,线性联系较好。血清中四种待测物在三个不同加标水平下的平均回收率在85.2%～114.0%之间,相对标准偏差在0.7%-8.5%之间。以上结果表明,该策略准确可靠,可用于实际样品的测定,为今后酪氨酸及其代谢产物的探讨提供了策略学的参考。关键词：酪氨酸及其代谢产物论文高效液相色谱-荧光检测论文高效液相色谱-串联质谱论文同步荧光论文生物样品论文固相萃取论文
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Abstract5-11
第一章 绪论11-28

1.1 氨基酸在肿瘤方面的探讨近况11-13

1.2 酪氨酸及其代谢产物的探讨近况13-26

1.2.1 酪氨酸及其代谢产物概况13-14

1.2.2 酪氨酸及其代谢产物浅析策略探讨14-24

1.2.3 酪氨酸及其代谢产物临床运用近况24-26

1.3 本论文探讨的主要内容26-28

第二章 偏最小二乘-导数同步荧光法同时测定生物样品中对羟乳酸、多巴和尿黑酸28-42

2.1 引言28-29

2.2 实验部分29-30论文导读：.2标准溶液的配制715.2.3血清样本的收集与处理715.2.4色谱条件71-725.2.5质谱条件725.3结果与讨论72-825.3.1色谱条件的优化72-735.3.2质谱条件的优化73-795.3.3标准曲线与检测限795.3.4策略回收率与精密度79-825.3.5样品测定825.4结论82-83第六章总结与展望83-85致谢85-86参考文献86-96攻读学位期间的探讨成果9

2.1 仪器与试剂29

2.2 标准溶液的配制29

2.3 实验策略29-30

2.3 结果与讨论30-41

2.3.1 激发与发射光谱30-31

2.3.2 同步荧光光谱31-33

2.3.3 单组分测定的线性范围及检出限33-35

2.3.4 干扰实验35-36

2.3.5 合成样品的测定36-39

2.3.6 因子数的选择39-40

2.3.7 实际样品的测定40-41

2.4 结论41-42

第三章 超高效液相色谱-荧光检测法同时测定人体血清中酪氨酸及其代谢产物42-56

3.1 引言42-44

3.2 实验部分44-46

3.

2.1 仪器与试剂44-45

3.

2.2 标准溶液的配制45

3.

2.3 血清样本的收集与处理45

3.

2.4 色谱条件45-46

3.3 结果与讨论46-55

3.1 色谱条件的选择与优化46-48

3.2 标准曲线与检测限48-49

3.3 干扰实验49

3.4 蛋白质沉淀剂的选择49-50

3.5 策略回收率与精密度50-52

3.6 样品测定52-55

3.4 结论55-56

第四章 固相萃取—超高效液相色谱—荧光检测法同时测定人体尿液中酪氨酸、对羟乳酸和对羟乙酸56-69

4.1 引言56-57

4.2 实验部分57-59

4.

2.1 仪器、试剂与材料57-58

4.

2.2 标准溶液的配制58

4.

2.3 尿液样本的收集与处理58

4.

2.4 色谱浅析条件58-59

4.3 结果与讨论59-68
4.

3.1 色谱条件的选择与优化59-60

4.

3.2 标准曲线与检测限60

4.

3.3 样品前处理策略选择60-62

4.

3.4 策略回收率与精密度62-65

4.

3.5 样品测定65-68

4.4 结论68-69
第五章 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定乳腺癌患者血清中多巴、酪氨酸、对羟乳酸和酪胺69-83

5.1 引言69-70

5.2 实验部分70-72

5.

2.1 仪器与试剂70-71

5.

2.2 标准溶液的配制71

5.

2.3 血清样本的收集与处理71

5.

2.4 色谱条件71-72

5.

2.5 质谱条件72

5.3 结果与讨论72-82
5.

3.1 色谱条件的优化72-73

5.

3.2 质谱条件的优化73-79

5.

3.3 标准曲线与检测限79

5.

3.4 策略回收率与精密度79-82

5.

3.5 样品测定82

5.4 结论82-83
第六章 总结与展望83-85
致谢85-86
参考文献86-96
攻读学位期间的探讨成果96