简谈猪瘟转录靶向Jiv基因shRNA细胞株建立及鉴定

论文导读：的增殖131.1.3CV基因组结构及蛋白功能13-161.2分子伴侣Jiv的发现161.2.1分子伴侣的介绍161.2.2分子伴侣Jiv的发现161.3CV与分子伴侣Jiv的相互作用16-18第二章RNA干扰技术探讨进展18-212.1RNA干扰的作用机制18-192.1.1转录水平的基因沉默182.1.2转录后水平的基因沉默182.1.3microRNA介导的翻译水平
摘要：猪瘟（Classical swine fever，C）是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CV)引起的猪的一种高度接触性急性热性传染病，分布广，危害大，严重影响着养猪业的进展。Jiv蛋白是猪细胞内的一种分子伴侣，在CV感染细胞时，该蛋白对CV的复制增殖具有重要调节作用。为进一步探讨Jiv蛋白对CV复制增殖的影响及发现对CV在细胞内增殖有重要调节作用的基因区段，为抗猪瘟转基因猪的探讨提供论述支持和材料准备，在前期探讨的基础上，针对猪Jiv基因设计筛选了靶向其4个基因位点的shRNA，构建了慢病毒载体，获得了稳定插入干扰片段的PK-15细胞株，对其干扰CV复制增殖作用进行了探讨；将对CV有显著干扰作用的shRNA插入猪胎儿成纤维细胞中，筛选获得阳性细胞株，并进行了鉴定。（1）根据GenBank CV基因组NS2基因序列设计并合成引物和TaqMan探针，通过各项条件优化并以10倍梯度稀释的质粒为标准品进行实时荧光定量PCR扩增制作标准曲线，建立了CV的TaqMan实时荧光定量PCR检测策略。该策略对标准品质粒检测的线性范围是1.0×109～1.0×101拷贝/μL，且具有较好的敏感性、特异性、重复性和可运用性。（2）针对Jiv基因4个不同位点设计了RNA干扰片段，构建成4种慢病毒RNA干扰载体P1、P2、P3、P4和无干扰片段载体NC。用获得的慢病毒载体转染PK-15细胞，通过筛选、鉴定获得5种阳性细胞株。通过Real-time PCR进行浅析，4种转入干扰载体的阳性细胞中Jiv基因表达量有不同程度的下调，其中P2PK-15细胞株Jiv基因表达量相对于对照组下调了95%。4种阳性细胞接种CV72h后，运用Real-time PCR对CV RNA进行检测，发现4种细胞株CV RNA表达量相对于对照组有不同程度的下调，其中P2PK-15下调了约85%，说明P2载体具有较好的干扰CV复制的作用。（3）通过组织块法原代细胞培养，以40日龄的猪胎儿中分离得到胎猪成纤维细胞。用P2慢病毒载体转染胎猪成纤维细胞，通过筛选、鉴定得到了稳定表达靶向Jiv基因shRNA的胎猪成纤维细胞株，其阳性率达99%，为抗猪瘟转基因猪的生产提供了核供体细胞。关键词：猪瘟病毒论文Jiv基因论文RNA干扰论文成纤维细胞论文
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ABSTRACT7-12
文献综述12-21
第一章 猪瘟病毒及其与猪 Jiv 蛋白作用探讨进展12-18

1.1 CV 的探讨进展12-16

1.1 CV 的形态及特点12-13

1.2 CV 的增殖13

1.3 CV 基因组结构及蛋白功能13-16

1.2 分子伴侣 Jiv 的发现16

1.2.1 分子伴侣的介绍16

1.2.2 分子伴侣 Jiv 的发现16

1.3 CV 与分子伴侣 Jiv 的相互作用16-18

第二章 RNA 干扰技术探讨进展18-21

2.1 RNA 干扰的作用机制18-19

2.

1.1 转录水平的基因沉默18

2.

1.2 转录后水平的基因沉默18

2.

1.3 microRNA 介导的翻译水平基因沉默18-19

2.2 siRAN 的制备策略19

2.3 RNA 干扰在抗 CV 中运用19-21

试验探讨21-52
第三章 猪瘟病毒 TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测策略的建立21-31

3.1 材料21-22

3.

1.1 主要试剂21

3.

1.2 主要仪器设备21

3.

1.3 病毒、质粒和菌种21

3.

1.4 试剂配制21-22

3.2 策略22-24
3.

2.1 引物和探针的设计及合成22

3.

2.2 标准品的制备22-23

3.

2.3 实时荧光定量 PCR 策略的建立23-24

3.

2.4 实时荧光定量 PCR 策略与常规 PCR 策略的比较24

3.

2.5 临床样品的检测24

3.3 结果24-29

3.1 目的片段的扩增及鉴定24-25

3.2 退火温度与引物和探针浓度的确定25

3.3 敏感性试验和标准曲线25-26

3.4 特异性试验26

3.5 重复性试验26-27

3.6 实时荧光定量 PCR 与常规 PCR 敏感性的比较27-28

3.7 临床样品的检测结果28-29

3.4 讨论29-30

3.5 小结30-31

第四章 转录靶向 Jiv 基因 shRNAPK-15 细胞株的建立及病毒干扰效果初步探讨31-44

4.1 材料31-32

4.

1.1 材料和试剂31

4.

1.2 主要仪器设备31-32

4.

1.3 试剂的配制32

4.2 策略32-36
4.

2.1 靶向 Jiv 基因 RNA 干扰载体的设计32

4.

2.2 慢病毒载体病毒滴度的复核32-33

4.2.3 转录靶向 Jiv 基因 shRNA 干扰片段 PK-15 细胞株的建立33-34
4.

2.4 实时荧光定量 PCR 检测阳性细胞 Jiv mRNA 的表达34-35

4.

2.5 阳性细胞抑制猪瘟病毒增殖作用的浅析35-36

4.3 结果36-42
4.

3.1 慢病毒载体转染 PK-15 细胞36

4.

3.2 阳性 PK-15 细胞的筛选36-37

4.

3.3 阳性细胞的鉴定37-38

4.

3.4 阳性细胞中 Jiv 基因 mRNA 的相对定量结果38-40

4.

3.5 阳性细胞干扰猪瘟病毒效果的检测40-42

4.4 讨论42-43

4.5 小结43-44

第五章 转录靶向 Jiv 基因 shRNA 猪胎儿成纤维细胞的建立及鉴定44-52

5.1 材料44-45

5.

1.1 试验用动物44

5.

1.2 仪器设备44

5.

1.3 试验耗材44

5.

1.4 主要试剂44-45

5.

1.5 试剂配制45

5.2 策略45-47
5.

2.1 胎猪成纤维细胞的分离培养45-46

5.论文导读：结果48-495.3.4阳性细胞的鉴定49-505.4讨论50-515.5小结51-52结论52-53参考文献53-60致谢60-62作者介绍62上一页12

2.2 细胞生长曲线测定46

5.

2.3 转录靶向 Jiv 基因 shRNA 干扰片段猪胎儿成纤维细胞株的建立46

5.

2.4 阳性细胞的鉴定46-47

5.3 结果47-50
5.

3.1 胎猪成纤维细胞的分离培养47-48

5.

3.2 胎猪成纤维细胞生长曲线的测定48

5.

3.3 慢病毒干扰载体 P2 侵染胎猪成纤维细胞及阳性细胞的筛选结果48-49

5.

3.4 阳性细胞的鉴定49-50

5.4 讨论50-51

5.5 小结51-52

结论52-53
参考文献53-60
致谢60-62
作者介绍62