浅议复性香鱼LECT2重组表达、复性、纯化与功能普通

论文导读：，这是否预示香鱼LECT2通过LCR对巨噬细胞产生作用。为进行这一探讨就必须有足够的LECT2蛋白。由此，本探讨首先对实验室构建保存的香鱼LECT2表达菌株(BL21plysE/pET28a-aLECT2)进行诱导表达，获得的诱导表达产物为包涵体。洗涤后，在superdex75柱上预先构建的一段尿素梯度，然后通过分子筛柱的滞留效应，使得目的蛋白和变性剂在柱
摘要：LECT2(leukocyte cell-derived chemotaxin2)在鱼类抗病原菌感染等免疫应答历程中起到重要作用。本实验室另有探讨报道，香鱼LECT2与C型凝集素受体(C-type lectin receptor, CLR)相互作用，CLR是多种免疫细胞表面的方式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)。鱼类巨噬细胞表面有着CLR，这是否预示香鱼LECT2通过LCR对巨噬细胞产生作用。为进行这一探讨就必须有足够的LECT2蛋白。由此，本探讨首先对实验室构建保存的香鱼LECT2表达菌株(BL21plys E/pET28a-aLECT2)进行诱导表达，获得的诱导表达产物为包涵体。洗涤后，在superdex75柱上预先构建的一段尿素梯度，然后通过分子筛柱的滞留效应，使得目的蛋白和变性剂在柱上分离并使其复性。结果表明，我们获得了纯度为95%的复性重组蛋白。为了验证复性蛋白活性，我们取香鱼主要免疫器官头肾，并通过细胞培养手段成功分离到其原代头肾细胞及其巨噬细胞。通过体外添加复性纯化后的香鱼LECT2蛋白，根据头肾细胞或头肾巨噬细胞的趋化性判断其体外活性。体外趋化实验结果表明，复性纯化后的蛋白香鱼LECT2具有趋化活性。在上面陈述的香鱼头肾巨噬细胞离体实验模型基础上，运用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术，构建了香鱼LECT2复性蛋白诱导的香鱼头肾细胞的SSH的正向cDNA文库，以正向文库中随机挑取500个克隆进行测序浅析，共获得473个高质量的ESTs。经序列拼接和BLAST比对，正库unigenes有272条(71.2%)与GenBank中已知功能基因具有较高的同源性。这些unigenes通过GO (Gene Ontology)基因功能注释和归类浅析。结果表明，正库已知功能的unigenes在生物历程第2层次中可分为20个类别，其中细胞历程、代谢历程和生物调节历程的比例最高，分别为19%、14%、12%。随后，以正向文库中挑选了10个免疫相关基因作进一步实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)验证。根据本实验测序获得的ESTs序列中设计定量引物进行，结果表明：在香鱼LECT2作用下，香鱼头肾细胞免疫相关基因被激活。本次探讨首次采取体外复性技术获得了香鱼LECT2具有活性的重组蛋白。在香鱼头肾巨噬细胞的离体模型中，SSH技术验证了LECT2对巨噬细胞的作用。本探讨首次报道了香鱼LECT2对巨噬细胞的功能，也为后期鱼类LECT2参与的信号转导途径提出了新的探讨方向。关键词：LECT2论文尿素梯度复性论文巨噬细胞论文趋化活性论文抑制消减杂交论文
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Abstract5-9
引言9-11
1 文献综述11-17

1.1 重组蛋白的探讨近况11-15

1.1 常规复性11-12

1.2 柱上复性12-15

1.2 LECT2 的探讨近况15-16

1.3 小结16-17

2 香鱼 LECT2 的诱导表达和前期处理17-24

2.1 实验材料17-18

2.

1.1 菌株17

2.

1.2 试剂17

2.

1.3 仪器17-18

2.2 实验策略18-20

2.1 香鱼 LECT2 诱导表达18-19

2.2 包涵体分离19

2.3 包涵体前期处理19

2.4 包涵体溶解19-20

2.3 结果与浅析20-21

2.3.1 重组香鱼 LECT2 诱导表达及鉴定20-21

2.3.2 包涵体处理21

2.4 讨论21-24

3 香鱼 LECT2 柱上复性纯化及二硫键验证24-34

3.1 实验材料25-26

3.

1.1 试剂25

3.

1.2 仪器25-26

3.2 实验策略与步骤26-29
3.

2.1 香鱼 LECT2 的复性26-27

3.

2.2 香鱼 LECT2 的纯化27-28

3.

2.3 香鱼 LECT2 的二硫键验证28-29

3.3 结果与浅析29-32
3.3.1 复性结果浅析29论文导读：策略35-404.2.1香鱼头肾细胞及巨噬细胞分离与培养354.2.2趋化活性验证35-364.2.3SSH文库构建36-404.3结果与浅析40-444.3.1香鱼LECT2对香鱼头肾细胞或头肾巨噬细胞的趋化情况40-414.3.2香鱼LECT2作用香鱼头肾巨噬细胞的SSH文库41-434.3.3差别基因基因的功能注释和浅析434.3.4SSH文库相关基因的RT-PCR验证4

3.2 纯化结果29-31

3.3 二硫键含量浅析31-32

3.4 讨论32-34

4 香鱼 LECT2 活性验证和功能浅析34-46

4.1 实验材料34-35

4.

1.1 实验动物34

4.

1.2 主要仪器34

4.

1.3 主要试剂34-35

4.2 实验策略35-40
4.

2.1 香鱼头肾细胞及巨噬细胞分离与培养35

4.

2.2 趋化活性验证35-36

4.

2.3 SSH 文库构建36-40

4.3 结果与浅析40-44
4.

3.1 香鱼 LECT2 对香鱼头肾细胞或头肾巨噬细胞的趋化情况40-41

4.

3.2 香鱼 LECT2 作用香鱼头肾巨噬细胞的 SSH 文库41-43

4.

3.3 差别基因基因的功能注释和浅析43

4.

3.4 SSH 文库相关基因的 RT-PCR 验证43-44

4.4 讨论44-46
5 结语46-48

5.1 探讨成果46-47

5.2 展望47-48

参考文献48-54
在学探讨成果54-55
致谢55