谈谈白细胞致病性坏死梭杆菌白细胞毒素部分融合基因真核表达及免疫活性大纲

论文导读：
摘要：以国内分离的牛源致病性坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum, F.n.)F4菌株基因组为模板，通过PCR和克隆技术构建高效真核表达载体，体外对重组的融合蛋白进行免疫特性和细胞毒性探讨。探讨内容如下：根据文献和生物信息学技术，参考GenBank已知白细胞毒素序列accession no.AF312861.3设计4对引物。利用PCR技术获得bsbse、gas-sh和sh三个基因片段，构建bsbse，gas-sh和sh三个TA克隆载体，前两者测序并提交序列。利用T4DNALigase和PCR技术获得bsbse-gas-sh和bsbse-sh两个融合片段并测序鉴定。构建pPIC9K-bsbse-sh和pPIC9K-bsbse-gas-sh真核分泌表达载体，转化原生质体KM71H酵母细胞；经过His-营养缺陷培养基，G418抗性培养基筛选和PCR鉴定，成功获得两株真核工程菌。探讨表明，经1.0%甲醇诱导发酵4d，BSBSE-SH和BSBSE-GAS-SH融合蛋白分泌到培养物上清液中并表达量最大，SDS-PAGE浅析重组蛋白大小分别约为53.2KD和117.9KD。在体外用Western Blot浅析目的蛋白的抗原特性，结果显示两条多肽都有印迹带。但是BSBSE-SH的重组蛋白有大的杂带，估计是重组蛋白的多聚体；而BSBSE-GAS-SH的带比较显著，推测在形成三维结构的时候疏水性片段GAS起了稳定、排斥的作用。以小鼠肝上皮细胞(NCTC clone1469)和小鼠巨噬细胞(Ana-1)作为靶向细胞，通过MTS还原试验，证实F.n. LktA融合蛋白BSBSE-SH和BSBSE-GAS-SH对两种细胞都有毒性；在倍比稀释后BSBSE-SH对小鼠肝上皮细胞的毒性更大。高浓度的重组蛋白可直接诱导细胞凋亡，低浓度可刺激细胞产生抵抗力。本探讨用真核表达载体对坏死梭杆菌白细胞毒素的重组蛋白进行了有效表达，为白细胞毒素A活性片段的纯化，结构、功能与F.n.亚单位疫苗的研制提供了基础数据。关键词：坏死梭杆菌论文白细胞毒素论文毕赤酵母论文融合蛋白论文细胞毒性论文
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Abstract7-15
第1章 绪论15-25

1.1 坏死梭杆菌白细胞毒素背景15

1.2 白细胞毒素遗传学探讨进展15-19

1.2.1 白细胞毒素 lktB15-16

1.2.2 白细胞毒素 LktA 和一级结构浅析16-17

1.2.3 LktA 二级结构浅析17-18

1.2.4 LktA 结构浅析18-19

1.2.5 白细胞毒素 lktC19

1.3 白细胞毒素免疫学探讨进展19-20

1.3.1 白细胞毒素免疫学背景19-20

1.3.2 白细胞毒素免疫学特性20

1.4 表达系统探讨进展20-24

1.4.1 原核表达系统20-21

1.4.2 酵母表达系统21-22

1.4.3 哺乳动物和昆虫细胞表达系统22-23

1.4.4 植物细胞表达系统23-24

1.5 结语24-25

第2章 坏死梭杆菌白细胞毒素 BSBSE-GAS-SH 融合及酵母表达25-41

2.1 实验材料和仪器25-26

2.

1.1 菌种和载体25

2.

1.2 主要仪器25

2.

1.3 酶及主要试剂25-26

2.2 实验策略26-35

2.1 引物设计26-27

2.2 表达载体构建流程图27

2.3 bsbse、gas-sh 扩增与回收27-28

2.4 bsbse、gas-sh 克隆与鉴定28-29

2.5 bsbse-gas-sh 克隆与鉴定29-30

2.6 BSBSE-GSS-SH 分泌表达酵母工程菌构建与诱导表达30-33

2.7 BSBSE-GAS-SH SDS-PAGE 电泳33-35

2.3 实验结果35-39

2.3.1 bsbse、gas-sh 克隆与鉴定35

2.3.2 表达片段 gas-sh 扩增35-36

2.3.3 bsbse-gas-sh 融合与鉴定36

2.3.4 重组表达载体构建并诱导表达36-37

2.3.5 BSBSE-GAS-SH SDS-PAGE 电泳论文导读：AGE电泳433.3实验结果与讨论43-473.3.1sh克隆与鉴定43-443.3.2bsbse-sh克隆与鉴定443.3.3重组表达载体鉴定44-453.3.4毕赤酵母转化子PCR鉴定45-463.3.5BSBSE-SHSDS-PAGE电泳46-473.4本章小结47-49第4章坏死梭杆菌白细胞毒素部分融合蛋白免疫活性浅析49-574.1实验材料与仪器49-504.

1.1主要材料494.2主要仪

37-39

2.4 讨论39-40

2.4.1 引物设计39

2.4.2 基因融合并真核载体构建39

2.4.3 毕赤酵母诱导表达39-40

2.4.4 有着不足和不足40

2.5 本章小结40-41

第3章 坏死梭杆菌白细胞毒素 BSBSE-SH 融合及酵母表达41-49

3.1 实验材料与仪器41

3.

1.1 菌种与载体41

3.

1.2 主要仪器41

3.

1.3 酶及主要试剂41

3.2 实验策略41-43
3.

2.1 引物设计41

3.

2.2 表达载体构建流程41-42

3.

2.3 sh 扩增与回收42

3.

2.4 sh 克隆与鉴定42

3.

2.5 bsbse-sh 融合与鉴定42-43

3.

2.6 BSBSE-SH 分泌表达酵母工程菌构建与诱导表达43

3.

2.7 BSBSE-SH SDS-PAGE 电泳43

3.3 实验结果与讨论43-47

3.1 sh 克隆与鉴定43-44

3.2 bsbse-sh 克隆与鉴定44

3.3 重组表达载体鉴定44-45

3.4 毕赤酵母转化子 PCR 鉴定45-46

3.5 BSBSE-SH SDS-PAGE 电泳46-47

3.4 本章小结47-49

第4章 坏死梭杆菌白细胞毒素部分融合蛋白免疫活性浅析49-57

4.1 实验材料与仪器49-50

4.

1.1 主要材料49

4.

1.2 主要仪器49

4.

1.3 主要试剂49-50

4.2 实验策略50-53
4.

2.1 重组蛋白浓度测定50

4.

2.2 重组蛋白初步浓缩 SDS-PAGE 电泳50

4.

2.3 重组蛋白 Western Blot 印迹50-51

4.

2.4 融合蛋白对细胞活力影响51-53

4.3 实验结果53-55
4.

3.1 重组蛋白浓度测定53

4.

3.2 重组蛋白初步浓缩 SDS-PAGE 电泳53

4.

3.3 重组蛋白 Western Blot 印迹53-54

4.

3.4 融合蛋白对细胞活力影响实验54-55

4.4 讨论55-56

4.1 重组蛋白浓度55

4.2 重组蛋白 Western Blot 印迹55

4.3 融合蛋白对细胞活力影响实验55-56

4.4 有着不足和不足56

4.5 本章小结56-57

结论57-59
参考文献59-65
附录65-79
附录165-67
附录267-69
附录369-75
附录475-79
攻读硕士学位期间所发表的学术论文79-81
致谢81