草鱼IL-8,克隆,转录水平,炎症,

论文导读：
摘要：目的白细胞介素8（白介素-8/IL-8）是一个碱基-肝素结合蛋白，属于CXC趋化因子，它的主要作用是介导炎症反应。现已在多种鱼类中克隆到IL-8的基因，并对其功能进行了初步探讨。草鱼（Ctenopharyngodon idella）不仅是我国的主要淡水养殖品种，也是世界第三大养殖品种，但草鱼抗病力差，易受各种致炎因子刺激发生炎症乃至死亡，严重影响草鱼养殖业的进展。本论文拟克隆草鱼IL-8的完整基因，并对其生物学功能进行初步鉴定。策略首先，运用Rapid apppcation of cDNA ends技术以草鱼中克隆IL-8cDNA全长序列，并通过原核表达质粒pET32a+表达IL-8融合蛋白。其次，运用Real-time PCR技术检测健康草鱼血液及12个组织的IL-8转录水平；同时经腹腔注射嗜水气单胞菌后4h，1d，3d，7d检测脑、心脏、肠道、中肾、脾脏、头肾、鳃、胸腺、表皮、尾鳍和肝脏等11个组织中的IL-8mRNA相对变化量。最后，利用扫描电镜技术和石蜡切片技术观察4h，1d，3d，7d时草鱼肠道结构的变化。结果草鱼IL-8的cDNA全长序列为609bp，其中包含5’非编码区96bp、3’非编码区216bp和开放阅读框297bp；其开放阅读框共编码98个氨基酸，与人的IL-8相似性为45%，预测的结构与人的IL-8空间结构及其相似。草鱼IL-8全长DNA包括四个外显子，结构组成与其它物种的IL-8内含子外显子排列相似；利用表达载体成功诱导表达IL-8融合蛋白，与预期大小一致。健康草鱼12个组织及血液的IL-8转录水平检测结果显示，IL-8在各个组织中都有转录，其中肝脏中最高，鳍和表皮仅次于肝脏，肠道、中肾、脾脏、头肾、鳃、胸腺等免疫相关组织的转录水平也较高。腹腔注射嗜水气单胞菌后各组织中IL-8mRNA相对变化量检测结果显示，脑和鳍的IL-8无变化；心脏、肠道、中肾、脾脏、头肾、鳃、胸腺、表皮和肝脏等9个组织中的IL-8mRNA分别在4h或1d达到最高值；其中，免疫相关组织中体现更为显著，3d后下降到正常水平。嗜水气单胞菌感染刺激后草鱼肠道的显微结构变化体现为，肠道内皮细胞在4h时有出现空泡变性，1d时粘膜下层结缔组织充血，细胞肿胀，固有层淋巴细胞聚集，3d时淋巴细胞多聚集于粘膜下层结缔组织，7d时肠道组织基本恢复正常。肠绒毛超微结构显示，肠道绒毛的破损在3d时最为显著，7d时基本恢复正常。结论本探讨成功克隆并表达了草鱼完整的炎症细胞因子IL-8，该基因在草鱼体内呈组成性表达；致病菌刺激后的免疫相关组织中IL-8转录水平分别在4h或1d达到最高峰，3d后下降到正常水平；肠道组织在致病菌刺激3d后的炎症反应达到高峰，7d后恢复正常，初步证实了IL-8与草鱼炎症反应有关，参与了草鱼体内的免疫调节。关键词：草鱼IL-8论文克隆论文转录水平论文炎症论文
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Abstract6-13
前言13-15
文献综述15-28

一、鱼类免疫系统的探讨进展15-22

1 鱼类的免疫器官15-16
2 鱼类的免疫细胞16-17
3 鱼类的体液免疫因子17-22

3.1 鱼类的溶菌酶17

3.2 鱼类的补体17-18

3.3 鱼类的免疫球蛋白18

3.4 鱼类的 C 反应蛋白18

3.5 鱼类的细胞因子18-22

3.5.1 白细胞介素18-20

3.5.2 趋化性细胞因子20

3.5.3 肿瘤坏死因子20

3.5.4 干扰素20-22

二、鱼类白细胞介素 8 的探讨进展22-28

1 IL-8 的产生及其分子结构22-23

1.1 人类的 IL-822

1.2 鱼类的 IL-822-23

2 IL-8 的信号转导23-24

2.1 人类的 CXC 受体23-24

2.2 鱼类的 IL-8 受体24

3 生物学功能与机理24-26

3.1 人类 IL-824-26

3.

1.1 趋化中性粒细胞25-26

3.

1.2 趋化碱性粒细胞26

3.

1.3 趋化 T 细胞26

3.2 鱼类 IL-826
4 本探讨的目的与作用26-28
第一章 草鱼白细胞介素-8 的分子克隆和原核表达28-50
1 材料与策略28-40

1.1 材料28-30

1.1 实验鱼28

1.2 菌株与质粒28

1.3 试剂和耗材28-30

1.4 引物与序列测定30

1.5 仪器设备30

1.2 策略30-39

1.2.1 实验器具的准备30-31

1.2.2 RNA 抽提31

1.2.3 用于做 RACE 和 IL-8 完整编码区克隆的 cDNA 的合成 ..31-32

1.2.4 草鱼 DNA 的提取32

1.2.5 草鱼 IL-8 的分子克隆32-36

1.2.6 IL-8 的原核表达36-39

1.3 结果浅析39-40

1.3.1 IL-8 cDNA 全长的浅析39

1.3.2 IL-8 基因全长的浅析39-40

1.3.3 原核表达结果的浅析40

2 结果40-47

2.1 IL-8 完整 cDNA40-45

2.

1.13 ’RACE 和 5’RACE40

2.

1.2 序列拼接与浅析40-45

2.2 IL-8 全基因序列45-46

2.1 IL-8 全基因序列的浅析45

2.2 IL-8 全基因序列的浅析45-46

2.3 IL-8 原核表达46-47

2.3.1 原核表达质粒的构建46-47

2.3.2 pET32a+-IL-8 的诱导表达47

3 讨论47-50
第二章 草鱼白细胞介素-8 功能的初步鉴定50-66
第一节 草鱼 IL-8 的表达方式探讨50-57
1 材料与策略50-53

1.1 材料50-51

1.1 实验动物和细菌50

1.2 试剂和耗材50-51

1.3 引物51

1.4 仪器设备51

1.2 策略51-53

1.2.1 草鱼的实验处理51-52

1.2.2 提取 RNA、去除 D论文导读：.2.1石蜡切片的取材与制作58-611.2.2电镜样品的取材与制作611.3结果浅析612结果61-622.1扫描电镜的结果61-622.2肠道切片的结果623讨论62-66全文结论66-67参考文献67-79攻读学位期间本人公开发表的论著、论文79-80致谢80-81上一页12
NA 并逆转录52-53

1.2.3 实时荧光定量 PCR53

1.3 结果浅析53

2 结果53-54

2.1 IL-8 和β-actin 产物单一性的检测53

2.2 IL-8 和β-actin 扩增效率的检测53-54

2.3 各组织及实验处理后 IL-8 的表达差别54

3 讨论54-57
第二节 嗜水气单胞菌感染后草鱼肠道炎症反应57-66
1 材料与策略57-61

1.1 材料57-58

1.1 实验鱼57

1.2 试剂和耗材57

1.3 药品配制57-58

1.4 仪器设备58

1.2 策略58-61

1.2.1 石蜡切片的取材与制作58-61

1.2.2 电镜样品的取材与制作61

1.3 结果浅析61

2 结果61-62

2.1 扫描电镜的结果61-62

2.2 肠道切片的结果62

3 讨论62-66
全文结论66-67
参考文献67-79
攻读学位期间本人公开发表的论著、论文79-80
致谢80-81