浅析脾脏感病草鱼脾脏比较转录组

论文导读：测样品荧光定量PCR45-461.2.6计算基因的相对定量表达462结果浅析46-532.1差别表达基因质量472.2差别表达基因的组织表达47-533讨论53-553.1草鱼补体旁路途径是机体防御出血病毒的特异性途径53-543.2趋化因子等细胞因子的协同作用使草鱼机体的补体旁路途径与凝血途径产生免疫级联反应对草鱼出血病进行防御54-554小结5
摘要：草鱼出血病长期制约草鱼养殖的健康可持续进展。目前,在草鱼出血病病原、病毒生物学、疫苗研制、免疫相关基因克隆以及转基因抗病草鱼探讨方面取得了一系列重要科研成就,但一直未能在遗传育种角度取得草鱼抗病育种的突破性进展。本论文采取转录组技术筛选与抗草鱼出血病病毒紧密相关的信号因子,试图为后续分子标记辅助育种或转基因育种策略解决草鱼出血病不足提供基础。本探讨选取1龄草鱼种,对感染草鱼出血病毒前后的草鱼脾脏进行转录组测序；分别取注射草鱼出血病毒后Oh、24h、48h、72h、96h、138h6个时间点,胸腺、鳃、肝脏、脾脏、头肾5个组织,通过Real-time PCR策略检测筛选出的差别表达因子的时序表达,进一步验证信号因子与草鱼出血病的相关性；实验获得如下革新性探讨结果：1、感染草鱼出血病毒前后草鱼脾脏转录组数据库共测2G+2G的数据量,测得4G转录组数据量,共得到109077条unigenes,其中包含108092条差别表达的unigenes,其中差别倍数在2倍以上的unigene数为32621条。其中上调20825条,下调11796条。2060条unigene核苷酸在KEGG数据库中未能预测编码蛋白质,可作为考虑新基因寻找点。2、筛选出2条与草鱼出血病紧密联系的信号通路共获得显著富集的免疫相关通路32条,其中差别最显著的为凝血-补体通路、造血细胞谱系通路、细胞吞噬体通路和细胞-细胞受体互作通路4条,差别表达显著的unigene多集合在凝血-补体通路和细胞-细胞受体互作通路这2条通路中。3、筛选出9个与草鱼出血病紧密相关的信号因子并探明其在草鱼攻毒草鱼出血病毒后的周期性表达规律荧光定量检测数据结合草鱼出血病症状,确定C3、C5、XCR1、F7、F2、PLG、 NGFR、CCR4、XCR1、X9个因子可能跟草鱼出血病毒诱导紧密有关的信号因子。4、首次克隆了草鱼补体因子C5-1基因和草鱼凝血因子FⅦ转录组数据得到草鱼补体因子C5-1基因,cDNA长度3078bp,位于5’端,该序列编码1019个氨基酸,为不完整ORF框,有起始子蛋氨酸M,但无终止子。RACE法扩增得到草鱼凝血因子FⅦ全长cDNA1480bp,开放阅读框1311bp,编码437个氨基酸。草鱼凝血因子Ⅶ基因与补体因子C5-1基因进化方向都与物种进化方向一致,且在结构上高度保守。关键词：草鱼论文脾脏论文转录组论文荧光定量论文
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Abstract5-11
第一章 文献综述11-22
1 草鱼出血病的症状与病原11-12

1.1 症状与感染11

1.2 病原11-12

1.3 草鱼出血病病毒株系12

2 草鱼免疫相关因子12-18

2.1 免疫球蛋白12-13

2.2 主要组织相容性复合体及相关蛋白13

2.3 干扰素及相关因子13-14

2.4 肿瘤坏死及抑制相关因子14-15

2.5 补体因子15-16

2.6 凝集素16-17

2.7 其他免疫相关因子17-18

3 鱼类凝血因子18-20
4 转录组与鱼类抗病育种20-21
5 论文探讨目的与作用21-22
第二章 感染草鱼出血病毒前后草鱼脾脏转录组浅析22-44
1 材料和策略22-26

1.1 材料22

1.1 健康草鱼种22

1.2 草鱼出血病毒22

1.2 策略22-26

1.2.1 人工攻毒22-23

1.2.2 取样23

1.2.3 样品RNA提取23

1.2.4 cDNA文库的制备和测序23-24

1.2.5 测序数据浅析24-25

1.2.6 测序评估25

1.2.7 基因表达注释25

1.2.8 基因差别表达浅析25-26

2 结果浅析26-39

2.1 RNA提取与质量检测26-27

2.2 产量统计27-28

2.3 组装结果统计28-29

2.4 All-unigene的功能注释29-31

2.4.1 All-unigene的COG分类30

2.4.2 All-unigene GO分类30-31

2.4.3 All-unigene的代谢通路浅析31

2.5 编码蛋白框预测31-32

2.6 表达差别uingene浅析32-39

2.6.1 差别表达基因筛选32

2.6.2 差别表达基因GO分类32-34

2.6.3 差别表达基因的通路富集浅析34-38

2.6.4 与草鱼出血病毒紧密关联的差别uingene38-39

3 讨论39-42

3.1 草鱼脾脏转录组数据库的库容39-40

3.2 草鱼体内应激草鱼出血病毒的免疫通路40-41

3.3 草鱼机体免疫草鱼出血病毒的因子41-42

4 小结42-44
第三章 免疫草鱼出血病信号因子筛选与周期表达44-56
1 材料和策略44-46

1.1 材料44

1.2 策略44-46

1.2.1 人工攻毒44

1.2.2 取样44

1.2.3 样品RNA提取及cDNA模板的合成44-45

1.2.4 荧光定量PCR引物设计45

1.2.5 待测样品荧光定量PCR45-46

1.2.6 计算基因的相对定量表达46

2 结果浅析46-53

2.1 差别表达基因质量47

2.2 差别表达基因的组织表达47-53

3 讨论53-55

3.1 草鱼补体旁路途径是机体防御出血病毒的特异性途径53-54

3.2 趋化因子等细胞因子的协同作用使草鱼机体的补体旁路途径与凝血途径产生免疫级联反应对草鱼出血病进行防御54-55
4 小结55-56
第四章 草鱼凝血因子FⅧ和补体C5-1CDNA克隆浅析56-72
1 材料和策略57-61

1.1 材料57

1.2 策略57-61

1.2.1 人工攻毒57

1.2.2 取样57

1.2.3 样品RNA提取57

1.2.4 cDNA的合成57-58

1.2.5 引物设计58

1.2.6 草鱼F7基因cDN段的扩增58-59

1.2.7 PCR产物的回收与纯化59-60

1.2.8 制备感受态细胞60

1.2.9 目的片段连接和转化60-6论文导读：一页12

1

1.2.10 序列浅析61

1.2.11 系统发育树的构建61

2 结果浅析61-70

2.1 FⅦ因cDNA序列及浅析61-66

2.

1.1 FⅦ3’-Race和5'-Race PCR扩增结果61-63

2.

1.2 FⅦ氨基酸序列浅析63

2.

1.3 FⅦ推导氨基酸及保守序列的结构63-64

2.

1.4 FⅦ氨基酸序列同源性浅析64-65

2.

1.5 FⅦ基因系统进化树构建65-66

2.2 C5-1基因cDNA序列及浅析66-70

2.1 C5-1基因部分序列及推导氨基酸浅析66-68

2.2 C5-1基因部分序列氨基酸序列同源性浅析和系统进化树构建68-70

3 讨论70-71
4 小结71-72
结论、革新点及探讨展望72-74
参考文献74-86
致谢86-87
作者介绍87-88