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简论罗汉果罗汉果转录组、表达谱高通量测序及甜苷V生物合成关键酶克隆

最后更新时间:2024-03-13 作者:用户投稿原创标记本站原创 点赞:14472 浏览:52701
论文导读:
摘要:罗汉果Siraitia grosvenorii (Swingle) C. Jeffrey是我国特有珍贵药用和甜料植物,为葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属(Siraitia)多年生藤本植物,具有止咳祛痰、凉血舒胃、润肠通便等作用。其主要成分甜苷V是世界上最强的非糖甜味物质之一,为蔗糖甜度的300-400倍,是一种低热量、纯天然的甜味剂及理想的保健品,此外还有抗氧化、免疫调节、抗癌、降血糖等作用。甜苷V目前还不能化学合成,主要依靠提取获得。罗汉果对生境要求苛刻,只适宜在广西生长,且栽培中不能连作,果实中甜苷V含量低,无法满足市场需求,由此亟待探讨提升甜苷V含量的新途径、新策略。本论文利用高通量测序技术对罗汉果果实的转录组和表达谱进行了探讨,以分子水平诠释罗汉果甜苷V生物合成的分子机理,大规模寻找罗汉果功能基因,并在此基础上克隆了甜苷V生物合成相关基因的全长。主要探讨结果如下:1.罗汉果授粉后30天到50天之间主要以苦味成分苷ⅡE为主,70天时含量急剧下降,检测不到苷ⅡE。苷Ⅲ只在50天果实中出现。苷V含量在50天之前含量低,在50天至70天之间急剧增加了25.9倍,至85天增加到最高含量。葡萄糖含量在30天和50天变化不显著,而70天下降了3.24倍。葡萄糖含量与苷ⅡE、苷V含量的变化有着一定的消长联系。2.运用Solexa高通量测序技术对罗汉果果实进行转录组测序,得到3.41G的原始数据,通过拼接得到43891条Unigenes。与次生代谢相关的unigenes有739条,其中涉及萜类骨架合成的Unigenes有60条。利用转录组数据发现了罗汉果甜苷V生物合成通路中几乎所有的基因,涉及到20种基因。另外还得到了80条P450基因Unigenes、72条glycosyltranerase基因的Unigenes和90条glucosyltranerase基因的Unigenes。这些Unigenes是今后对罗汉果三萜皂苷生物合成进行全面调控的重要基因资源。3.在3d、50d、70d表达谱中均得到了300万条以上Clean tags,去冗余后得到85000条以上不同种类的Tags。通过浅析发现占mRNA总量近73-76%的是种类不到5.1-5.9%的少数mRNA,而占种类56-59%的mRNA全部加起来不到mRNA,总量的3.9-4.1%。对差别基因进论文导读:还得到了2条糖基转移酶的全长。并对所有全长基因进行了序列浅析,它们均为首次以罗汉果中报道的全长或部分片段序列。本论文首次利用Solexa高通量测序技术对罗汉果果实的转录组及不同时期的表达谱进行浅析,得到了大量的罗汉果基因信息,并克隆了涉及罗汉果甜苷V生物合成相关的基因全长。这为罗汉果功能基因组学以及甜苷V生上一
行统计发现在3d/50d中,有2119个基因上调,2642个基因下调;3d/70d中,2150个基因上调,2797个基因下调;50d/70d中,1078个基因上调,1422个基因下调。4.利用表达谱对罗汉果甜苷V生物合成途径涉及的20种基因在各个时期的表达水平进行浅析发现除AACT、MVD、CMK、HDS、SQS基因表达量在3个时期中未见显著变化外,其余16个基因都有各自的变化规律。授粉后3天到50天之间,DXS、DXR、MCS、IDS下调,其余12种基因均上调。50天到70天之间,HMGR、MCS、IDS、IPP, GPS、FPS、CAS下调外,其余9种个基因均上调。以3天幼果到70天接近成熟果实,各个基因表达的总体走势是:除DXR、MCS、IDS、IPP-I体现下调外,HMGS、HMGR、MK, PMK、MCT、IPI-Ⅱ、GPS、FPS、SQS、CAS和CS基因均上调。其中SQE和CS变化最大,70天比3d的表达量分别提升了8.89倍和9.69倍。5.通过对80条Cytochrome P450Unigenes和90条glucosyltranerase Unigenes基因表达水平变化规律进行探讨,推测Unigene23541、Unigene24189、Unigene26598和Unigene43109等4条候选的P450基因和Unigene4016、Unigene8672、 Unigene13633、Unigene15400、Unigene35056和Unigene38974等6条候选的UDPG基因可能参与甜苷V骨架生物合成。5.利用RACE技术首次克隆了14条罗汉果甜苷V生物合成相关的基因全长和4条5’或3’片段。其中MVA途径有6条:AACT、HMGS、HMGR、MK、PMK、MVD;共同代谢途径中IPI、GPS、FPS、SQS、CAS、CS等6条,以及SQE5’端;MEP途径中MCT和IDS基因的全长、DXS和HDS的5’端以及MCS的3’端。此外还得到了2条糖基转移酶的全长。并对所有全长基因进行了序列浅析,它们均为首次以罗汉果中报道的全长或部分片段序列。本论文首次利用Solexa高通量测序技术对罗汉果果实的转录组及不同时期的表达谱进行浅析,得到了大量的罗汉果基因信息,并克隆了涉及罗汉果甜苷V生物合成相关的基因全长。这为罗汉果功能基因组学以及甜苷V生论文导读:类15-162.2蛋白质、氨基酸类162.3黄酮类16-172.4甘露醇172.5单糖及多糖类17-182.6脂肪酸类182.7其他成分183罗汉果药理方面的探讨18-193.1止咳祛痰作用183.2免疫作用183.3降血糖作用18-193.4抗癌作用193.5抗氧化活性作用193.6毒性193.7对肠胃的影响194罗汉果组织培养及分子生物学方面的探讨19-205罗汉果苷生
物合成分子机理探讨打下了坚实的基础。关键词:罗汉果论文三萜皂苷论文生物合成途径论文甜苷V论文转录组论文表达谱论文RACE论文
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英文摘要8-10
前言10-12
第一章 罗汉果探讨进展12-37
1 罗汉果生药学的探讨12-15

1.1 生物学特性12

1.2 罗汉果名称的由来12-13

1.3 种质资源的收集及利用13-15

2 罗汉果化学成分的探讨15-18

2.1 葫芦烷三萜苷类15-16

2.2 蛋白质、氨基酸类16

2.3 黄酮类16-17

2.4 甘露醇17

2.5 单糖及多糖类17-18

2.6 脂肪酸类18

2.7 其他成分18

3 罗汉果药理方面的探讨18-19

3.1 止咳祛痰作用18

3.2 免疫作用18

3.3 降血糖作用18-19

3.4 抗癌作用19

3.5 抗氧化活性作用19

3.6 毒性19

3.7 对肠胃的影响19

4 罗汉果组织培养及分子生物学方面的探讨19-20
5 罗汉果苷生物合成途径的探讨20-27
6 展望27
参考文献27-37
第二章 罗汉果不同时期果实内含物变化规律37-48

一、引言37-40

1 罗汉果苷类探讨37-38
2 葡萄糖在罗汉果苷以低糖苷向高糖苷转化中起关键作用38-39
3 本探讨的目的和作用39-40
4 探讨内容40

二、材料与策略40-42

1 实验材料40

1.1 实验材料40

1.2 实验试剂40

2 实验策略40-42

2.1 甜苷ⅡE、Ⅲ、Ⅴ的提取及检测41

2.2 糖类成分及淀粉的提取及测定41-42

三、结果与浅析42-44

1 罗汉果苷类标准品保留时间42
2 苷类成分含量42-43
3 糖类成分含量43-44

四、讨论44-45

1 罗汉果苷类的变化规律44-45
2 糖类成分变化规律45

五、结论45-46

参考文献46-48
第三章 利用高通量测序技术探讨罗汉果果实的转录组及表达谱48-82

一、引言48-55

1 差别表达基因探讨策略48-54

1.1 SSH文库48-49

1.2 基因芯片49-51

1.3 EST文库筛选技术51-52

1.4 第二代高通量测序技术52-54

2 探讨的目的和作用54-55
3 探讨的内容55
二 材料与策略55-60论文导读:能浅析91-1762.1MVA途径全长基因浅析91-1232.2共同途径(Commonpathway)123-1622.3MEPpathyway162-1763糖基转移酶176-1863.1M28-101-GT1177-1823.2M28-581-GT2182-186四讨论186-1881高通量测序技术组装的可信度1862RACE历程中的不足及经验186-1873糖基转移酶在罗汉果苷代谢中的作用187-188五结论188参考文献188

1 实验材料55-56

1.1 植物材料55

1.2 主要试剂55-56

1.3 主要仪器56

2 实验策略56-60

2.1 总RNA的提取(改良Trizol法)56-57

2.2 转录组测序57-59

2.3 表达谱测序59-60

三、结果与浅析60-72

1 RNA提取60
2 转录组测序60-67

2.1 原始测序数据产量60

2.2 中级浅析结果60-67

3 表达谱测序67-72

3.1 原始数据统计67-69

3.2 基因注释及差别表达基因的筛选69

3.3 罗汉果苷生物合成相关基因表达水平69-70

3.4 候选P450的筛选70-71

3.5 候选GT的筛选71-72

四、讨论72-77

1 RNA提取策略的选择72-73
2 高通量测序技术在基因挖掘中的作用73-74
3 罗汉果生物合成途径相关酶的挖掘74
4 转录组和表达潜的结合为基因克隆提供了新的思路74-77
参考文献77-82
第四章 罗汉果苷生物合成关键酶的RACE克隆及浅析82-190

一、引言82-85

1 全长cDNA克隆的对策82
2 RACE技术82-83
3 探讨的目的和作用83-84
4 探讨的内容84-85

二、材料与策略85-90

1 材料与策略85-86

1.1 试验材料85

1.2 主要试剂85

1.3 主要仪器85-86

2 实验策略86-90

2.1 RACE全长克隆86-87

2.2 胶回收87-88

2.3 T-A克隆88

2.4 差别表达基因cDN段的测序及浅析88-89

2.5 部分差别基因的qRT-PCR浅析89-90

三、结果与浅析90-186

1 罗汉果苷生物合成途径中相关基因全长克隆90-91
2 罗汉果苷生物合成相关基因功能浅析91-176

2.1 MVA途径全长基因浅析91-123

2.2 共同途径(Common pathway)123-162

2.3 MEP pathyway162-176

3 糖基转移酶176-186

3.1 M28-101-GT1177-182

3.2 M28-581-GT2182-186

四、讨论186-188

1 高通量测序技术组装的可信度186
2 RACE历程中的不足及经验186-187
3 糖基转移酶在罗汉果苷代谢中的作用187-188

五、结论188

参考文献188-190
附录190-192
致谢192-194