谈谈感染性高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp2对病毒致弱及复制影响

论文导读：FS)病原已被证实为变异的北美洲型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV),HP-PRRSV的显著特点是基因组非结构蛋白编码区Nsp2不连续缺失30个氨基酸。本探讨室分离的HP-PRRSVTJ株经细胞克隆传代获得致弱毒株TJM。为探讨PRRSV病毒复制和毒力增强的致病分子机制,我们克隆测序浅析TJ株系列代次Nsp2基因的特性,利用真核表达和R
摘要：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS),又称“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的接触性传染病,PRRSV主要引起怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重的繁殖障碍及仔猪的呼吸道症状和死亡。该病以美国首次发现以来,一直对世界各国养猪行业危害严重。2006年我国暴发的“猪高热综合征”(porcine high fever syndrome, PHFS)病原已被证实为变异的北美洲型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV),HP-PRRSV的显著特点是基因组非结构蛋白编码区Nsp2不连续缺失30个氨基酸。本探讨室分离的HP-PRRSV TJ株经细胞克隆传代获得致弱毒株TJM。为探讨PRRSV病毒复制和毒力增强的致病分子机制,我们克隆测序浅析TJ株系列代次Nsp2基因的特性,利用真核表达和RNA干扰技术探讨TJ株Nsp2蛋白在其复制中的作用效果,建立HP-PRRSV的反向遗传学技术操作平台,分别成功构建了HP-PRRSV TJ株和疫苗株TJM的感染性cDNA克隆。根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJ株F3代全基因序列(GenBank号：EU860248),并结合多个PRRSV亚洲株Nsp2基因比对结果,设计合成引物,扩增HP-PRRSVTJ株噬斑克隆纯化前后的14个不同代次的Nsp2基因高变区片段及TJ株F3代和TJM(F92代)Nsp2全基因,并进行产物克隆测序和氨基酸序列浅析及结构预测。测序结果表明PRRSV TJ株在噬斑克隆传代历程中出现序列整段缺失,共120个氨基酸,并且以17代噬斑克隆后到122代一直稳定有着。TJM Nsp2缺失的高变区及Nsp2蛋白二级结构预测表明,缺失的氨基酸使Nsp2蛋白在空间结构上发生较大的变化,推测这可能与PRRSV TJM内毒力和致病力减弱有联系。6对强弱毒Nsp2蛋白序列比对结果表明TJ/TJM对间的序列差别更大,TJM疫苗株的返强几率就更低。为了探讨Nsp2蛋白的表达对PRRSV的增殖的具体影响,构建了表达PRRSV TJ株和其致弱毒TJM株Nsp2蛋白的真核质粒,携带有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein EGFP)基因表达盒,转染真核质粒,G418筛选,获得稳定表达PRRSVTJ株和TJM株Nsp2蛋白的Marc-145细胞系。接种PRRSV后,病毒在Marc-145-TJ(Nsp2)和Marc-145-TJM细胞系上增殖更快,镜下观察感染细胞早期,PRRSV在表达Nsp2蛋白的细胞系上病变更大更显著,并且最终病毒的滴度高于对照。结果表明Nsp2蛋白对PRRSV复制早期有正向调控作用。PRRSV在Marc-145-TJM(Nsp2)上的增殖系数比Marc-145-TJ(Nsp2)上小,推测120aa的缺失可能影响了Nsp2对病毒的调控作用。为探讨Nsp2基因短干扰RNA对PRRSV复制的抑制作用,构建了针对PRRSV Nsp2的3个基因特异性shRNA表达载体,shRNA载体转染Marc-145细胞6h以后,用0.01MOI的PRRSV TJ株接毒,通过CPE、RT-PCR半定量和病毒滴度测定来检测病毒复制,结果表明,3个Nsp2的基因特异性siRNA都能够有效抑制PRRSV在Marc-145细胞内的复制和增殖,特别是在PRRSV复制早期。其中shRNA载体S-1和S-2处理细胞接毒后,病毒滴度TCID50降低显著,最多降低103.38,与空载体比较差别极显著(t检验P0.001)。本实验根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJ株基因组序列设计并合成PRRSV特异性引物,进而运用RT-PCR技术分7段分别扩增了HP-PRRSV TJ株和其致弱毒TJM全基因组cDNA。将扩增的每个病毒的各个cDNA重叠片段分别克隆到pCR-Blunt穿梭载体上。在基因组5’末端和3’末端Poly(A)尾后通过Overlap PCR技术引入HAM Rz和HDV Rz序列及酶切位点SnaB I及NotI酶切位点。将TJ株基因组第15143位C沉默突变为A和15148位C沉默突变为T,产生一个M1uI酶切位点作为鉴定拯救病论文导读：毒载体上的运用30-331.8.1探讨结构蛋白的功能30-311.8.2探讨非编码区和非结构蛋白的功能311.8.3在探讨新型疫苗和基因载体的上的运用31-331.9探讨的目的作用33-34第二章PRRSVTJ株和TJM株NSP2基因特性的探讨34-472.1材料和策略34-362.1.1毒株和细胞342.1.2载体、菌株及试剂34-352.1.3引物的设计与合成352.1.4病毒R
毒的遗传标记。酶切、测序鉴定准确的各片段经5步亚克隆连接到pcDNA3.1真核表达载体上。将鉴定准确的含TJ株基因组全长cDNA的质粒和含TJM株基因组全长cDNA的质粒去内毒素纯化,转染Marc-145细胞,冻融物在Marc-145细胞上盲传,拯救出病毒。通过间接免疫荧光和遗传标记检测证明强弱毒重组病毒均拯救成功。比较强弱毒亲本病毒与拯救病毒的病毒滴度、多步生长曲线,发现病毒学及生物学特性没有显著差别。以上结果表明HP-PRRSV TJ株和其致弱毒TJM株感染性克隆构建成功,为探讨PRRSV的分子生物学特性、致病机制和研制有效的标记疫苗奠定了基础。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒论文反向遗传论文非结构蛋白2论文RNA干扰论文感染性cDNA克隆论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要6-8
Abstract8-17
第一章 绪论17-34

1.1 PRRS的病原、分类与流行17-19

1.2 PRRSV的致病机理19-20

1.3 PRRSV的基因组结构与复制20-21

1.4 PRRSV的编码蛋白及其功能21-24

1.4.1 PRRSV非结构蛋白21-23

1.4.2 PRRSV结构蛋白23-24

1.5 PRRSV遗传变异24-27

1.5.1 非结构蛋白的变异24-26

1.5.2 结构蛋白的变异26

1.5.3 非编码区序列变异26-27

1.6 PRRSV毒力因子27-29

1.6.1 Nsp2基因变异与PRRSV毒力的联系27-28

1.6.2 其他毒力相关因子28-29

1.7 PRRSV检测29-30

1.7.1 病毒分离29

1.7.2 核酸检测29

1.7.3 抗原抗体检测29-30

1.8 反向遗传系统在探讨PRRSV基因功能及进展新型疫苗和病毒载体上的运用30-33

1.8.1 探讨结构蛋白的功能30-31

1.8.2 探讨非编码区和非结构蛋白的功能31

1.8.3 在探讨新型疫苗和基因载体的上的运用31-33

1.9 探讨的目的作用33-34

第二章 PRRSV TJ株和TJM株NSP2基因特性的探讨34-47

2.1 材料和策略34-36

2.

1.1 毒株和细胞34

2.

1.2 载体、菌株及试剂34-35

2.

1.3 引物的设计与合成35

2.

1.4 病毒RNA制备35

2.

1.5 RT-PCR反应35

2.

1.6 PCR产物的克隆与鉴定35-36

2.

1.7 序列测定及浅析36

2.2 结果36-44

2.1 RT-PCR扩增结果36-37

2.2 RT-PCR产物的克隆及鉴定37-38

2.3 重组质粒的测序及比对结果38-39

2.4 缺失的120 aa的蛋白序列结构浅析39-40

2.2.5 PRRSV TJ株F3代和TJM-F92的Nsp2蛋白二级结构预测40-41
2.2.6 PRRSV TJ株、TJM和VR-2332的Nsp2基因RNA序列结构比较41-42

2.7 鉴别检测TJM与HP-PRRSV42

2.8 6对PRRSV强弱毒Nsp2基因氨基酸比对及进化树构建42-44

2.3 结论与讨论44-47

第三章 稳定细胞系的建立及NSP2蛋白对PRRSV复制的影响47-57

3.1 材料和策略47-49

3.

1.1 病毒、细胞、菌种和质粒47

3.

1.2 试剂47

3.

1.3 PRRSV TJ株和TJM株Nsp2全基因表达片段的克隆测序47-48

3.

1.4 重组真核表达载体的构建48

3.

1.5 G418最佳工作浓度的确定48

3.

1.6 重组真核表达载体的转染与细胞系的筛选48

3.

1.7 Nsp2在Marc-145细胞系中的表达检测48-49

3.

1.8 细胞生长曲线的绘制49

3.

1.9 PRRSV在细胞系上增殖的测定49

3.2 结果49-55
3.

2.1 PRRSV Nsp2全基因表达片段的克隆49-50

3.

2.2 重组真核表达载体的构建与鉴定50

3.

2.3 G418最佳工作浓度的确定50-51

3.

2.4 表达Nsp2细胞系的筛选51

3.

2.5 PRRSV Nsp2基因在Marc-145细胞中的表达检测51-54

3.

2.6 细胞生长曲线54

3.2.7 PRRSV在细胞系上的增殖54-论文导读：建594.1.4shRNA表达载体的转染及病毒的感染594.1.5半定量RT-PCR检测shRNA表达载体抑制效果594.1.6shRNA干扰后病毒滴度测定594.2结果59-654.2.1shRNA的扩增、测序及表达载体的构建59-604.2.2shRNA表达载体转染效率及对PRRSV的抑制作用60-624.2.3半定量RT-PCR检测PRRSVNsp2mRNA相对表达量62-644.2.4病毒滴度测定64-
55

3.3 讨论55-57

第四章 用NSP2基因小干扰RNA抑制PRRSV复制的探讨57-67

4.1 材料与策略57-59

4.

1.1 病毒、细胞和质粒57

4.

1.2 引物设计与合成57-59

4.1.3 siRNA的筛选及PRRSV TJ株Nsp2蛋白基因ShRNA表达载体构建59
4.

1.4 shRNA表达载体的转染及病毒的感染59

4.

1.5 半定量RT-PCR检测shRNA表达载体抑制效果59

4.

1.6 shRNA干扰后病毒滴度测定59

4.2 结果59-65
4.

2.1 shRNA的扩增、测序及表达载体的构建59-60

4.

2.2 shRNA表达载体转染效率及对PRRSV的抑制作用60-62

4.

2.3 半定量RT-PCR检测PRRSV Nsp2 mRNA相对表达量62-64

4.

2.4 病毒滴度测定64-65

4.3 讨论65-67
第五章 高致病性PRRSV强弱毒全长感染性克隆的构建67-86

5.1 材料和策略67-73

5.

1.1 病毒、细胞和质粒67

5.

1.2 试剂67-68

5.

1.3 全长构建对策及引物的设计合成68

5.

1.4 病毒RNA提取及RT-PCR反应获得cDN段68

5.

1.5 病毒cDNA的克隆和测序68

5.

1.6 全长cDNA克隆的构建及鉴定68-69

5.

1.7 全长cDNA克隆的转染69

5.

1.8 重组病毒的检测69-70

5.

1.9 病毒多步生长曲线的绘制70

5.

1.10 病毒细胞半数感染量(TCID_(50))测定70-73

5.2 结果73-83
5.

2.1 PRRSV TJ株和TJM株全基因组序列分段扩增及测序结果73-74

5.

2.2 PRRSV TJM株全基因组序列与亲本毒TJ株全序列的比较74-75

5.

2.3 遗传标记的引入75-76

5.

2.4 全长cDNA克隆获得76-77

5.

2.5 PRRSV全长cDNA序列的测序结果77-78

5.

2.6 全基因比对78-79

5.

2.7 重组PRRSV的拯救79

5.

2.8 重组PRRSV的鉴定79-81

5.

2.9 重组病毒生长动力学81-83

5.3 讨论83-86
第六章 全文结论86-87
参考文献87-100
附录100-107
致谢107-108
作者简历108-110