高低代次高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Marc-145细胞适应性差异探讨

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摘要：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)引起的一类致使怀孕母猪流产和仔猪呼吸障碍的疾病论文大纲怎么写。PRRSV具有严格的宿主细胞嗜性,只有少数几个细胞系适合PRRSV的感染与增殖。包括细胞受体与胞内大分子物质在内的多个因素影响PRRSV感染宿主细胞的。PRRSVGD株体外传代的中,各代次的TCID50值随代次增加而上升。将体外传5代与100代的PRRSV GD株感染Marc-145细胞,两者产生CPE的时间差异,5代34小时,而100代则缩短为24小时。对5代至100代之间PRRSV GD株的基因组全序列测序分析,在体外传代中,基因组全序列共有29个碱基发生了突变,这些突变导致了18个氨基酸突变的发生。约有77.8%的氨基酸突变发生在50代之前,而66.7%的氨基酸突变发生在编码非结构蛋白的开放阅读框中。使用UTRscan对5'UTR功能元件分析,变化发生。PRRSV GD株不同代次之间基因结构的变化可能是导致不同代次病毒在Marc-145细胞上细胞适应性差异的原因之一毕业论文提纲。编码非结构蛋白与编码结构蛋白的ORF中均有氨基酸基突变的发生,很难哪类氨基酸突变导致了病毒宿主细胞适应性的变化毕业设计论文。PRRSV对于细胞基因组转录调控的差异可能是造成宿主细胞适应性差异的原因之一。使用消减抑制杂交技术,构建反映感染不同代次PRRSV GD株Marc-145细胞mRNA转录差异的表达基因cDNA差异文库。选取感染后12小时、24小时和36小时3个时间点观察在不同时间差异基因的情况。对差异基因测序并BLAST,发现11种来Marc-145细胞与灵长类动物同源的基因和4种未知基因为转录差异基因教师论文。11种已知基因中有6个是核糖体蛋白基因。这些基因的研究较少,这些基因的功能尚不清楚。实验结果感染高低代次PRRSV GD株的Marc-145细胞基因转录情况确实存在差异,差异可能与宿主细胞适应性差异有关本科。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒论文Macr-145细胞适应性论文消减抑制杂交论文差异基因论文
摘要3-4
ABSTRACT4-5
插图和附表清单5-6
英文缩写表6-7
目录7-9
章 引言9-20

1.1 高致病性蓝耳病的研究进展9-12

1.1 HP-PRRSV的遗传学分析9-10

1.2 HP-PRRSV致病力的研究10

1.3 检测方法10-11

1.4 HP-PRRSV疫苗研究11-12

1.2 影响PRRSV感染宿主细胞的因素12-16

1.2.1 细胞受体12-14

1.2.2 胞内大分子物质14-15

1.2.3 细胞因子的作用15

1.2.4 小结15-16

1.3 实验研究内容与主要方法16-19

1.3.1 实验研究内容16

1.3.2 实验主要方法-消减抑制杂交技术16-19

1.4 研究的目的与19-20

章 PRRSV GD株不同代次间Marc-145细胞适应性比较与基因组全序列的测定20-34

2.1 20-22

2.

1.1 细胞与毒株20

2.

1.2 生物试剂20-21

2.

1.3 溶液配制21

2.

1.4 主要仪器设备21-22

2.2 实验方法22-26

2.1 Marc-145细胞的培养22

2.2 PRRSV GD株的体外传代22

2.3 PRRSV GD株体外传代各代次TCID_(50)值的测定22

2.4 PRRSV GD株体外传代各代次CPE产生时间的观察22-23

2.5 总RNA的提取23

2.6 RT-PCR23-25

2.7 PCR产物电泳验证25

2.8 PRRSV GD株各代次基因组全序列测序结果的分析25

2.9 PRRSV GD株基因组全序列5'UTR的序列分析25-26

2.3 实验结果26-32

2.3.1 PRRSV GD株体外传代各代次TCID_(50)值26-27

2.3.2 PRRSV GD株体外传代各个代次CPE时间观察结果27-28

2.3.3 PCR扩增产物电泳检测结果28

2.3.4 高低代次PRRSV GD株基因组全序列碱基突变分析28-30

2.3.5 高低代次PRRSV GD株基因组全序列氨基酸突变分析30-32

2.3.6 PRRSV GD传代毒株5'UTR的序列分析32

2.4 讨论32-34

章 Marc-145细胞基因转录差异文库的建立34-50

3.1 实验34-37

3.

1.1 细胞与毒株34

3.

1.2 生物试剂34-35

3.

1.3 溶液配制35-36

3.

1.4 主要仪器设备36-37

3.2 实验方法37-44
3.

2.1 Marc-145细胞的培养37

3.2.2 PRRSV GD株5代与100代感染Marc-145细胞CPE产生时间观察37
3.

2.3 mRNA的提取37-38

3.

2.4 mRNA链cDNA的合成38

3.

2.5 链cDNA合成38-39

3.

2.6 双链cDNA末端修饰39

3.

2.7 双链cDNA的RsaⅠ酶切消化39

3.

2.8 接头的制备39-40

3.

2.9 消化产物与接头连接40

3.

2.10 消减抑制杂交40-41

3.

2.11 套式PCR扩增差异基因41-42

3.

2.12 PCR产物与T载体连接42

3.

2.13 构建载体的转化与克隆42-43

3.

2.14 检测与测序43

3.

2.15 构建文库的序列分析43-44

3.3 实验结果44-48
3.3.1 PRRSV GD体外传代毒株5代与100代感染Marc-145细胞之后CPE产生情况44

3.2 RsaⅠ酶切图44-45

3.3 PCR检测图45-47

3.4 差异基因文库的构建47-48

3.4 讨论48-50

章 50-51

4.1 实验总结50

4.2 下一步工作设想50-51

参考文献51-56
致谢56-57
作者简历57