简析弧菌病原细菌溶藻弧菌和铜绿假单胞菌中致病相联系统调控机制

论文导读：转录。由此,腺苷作为一个跨界信号抑制某些铁摄取基因的表达,降低了铜绿假单胞菌的毒力。本探讨作用在于提出了一个新的无毒的策略(添加腺苷)来抑制生物被膜的形成和降低毒力,并且对于最重要的毒力调节因子之一的Fur蛋白在铜绿假单胞菌中是如何受到制约的这一不123下一页
摘要：溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一种重要的动物致病菌,弧菌病暴发可以引起海水养殖动物的高死亡率,在欧洲和南亚等地导致重大的经济损失。该菌黏附宿主表面,形成细胞被膜,具有产生如外毒素碱性丝氨酸蛋白酶(Asp)和铁载体等胞外产物的能力。这些毒力机制与其致病性密切相关。病原菌主要依赖多种分泌系统分泌的胞外蛋白的活性来利用养分、侵染宿主和适应环境。第六型分泌系统(T6SS)是一种新发现的、保守的细菌蛋白转运系统,在革兰氏阴性细菌中受到严谨的调控。在溶藻弧菌中有着两套T6SS基因簇(T6SSVA1和T6SSVA2),可以编码T6SS标志蛋白Hcp.VgrG以及IcmF,还包括丝氨酸-苏氨酸激酶／磷酸酶(PpkA和PppA)。多种与T6SS相关的细菌生理现象已经被报道,但是其内在机制尚不清楚。本探讨发现T6SS的标志蛋白溶血素共调蛋白(Hcp1)的表达受到严谨的调控。进一步的实验发现,Hcp1的表达具有生长依赖性,在指数期时达到最高。群体感应系统(Quorum sensing, QS)中的调节因子LuxO和LuxR分别正调控和负调控该蛋白的表达。此外,可替换sigma因子RpoN以及由T6SSVA1基因簇中基因编码的增强子结合蛋白VasH也可以调控Hcp1的表达。T6SSVA1中不仅Hcp1基因,其他基因如icmFl、dpⅥ和vasA1也受到LuxR、RpoN和VasH的负调控。总之,本探讨表明在溶藻弧菌中T6SS的表达受到了QS和可替换sigma因子的调控。本探讨第一次在溶藻弧菌中将T6SS分泌系统、QS以及与3’,5’-环二鸟苷酸(c-di-GMP)相关的多种毒力表型联系起来。两个T6SS基因簇的框内无标记缺失显示,T6SS的突变可以影响细菌的运动性、生物被膜形成、细胞聚集以及外毒素Asp的产生能力。Al和pppA的缺失导致了Hcp1蛋白表达水平的转变,pppA的缺失促使分泌系统的开启,标志着这两个基因对于T6SS调控的重要作用。PppA/PpkA1通过制约胞内第二信使c-di-GMP的水平来制约多种表型的变化。更重要的是,PppA/PpkA1可以通过制约群体感应调节因子LuxR来调控Asp的表达,而在本实验室之前的探讨中已经证明了LuxR对Asp的表达有正调控作用。全基因组转录谱浅析结果表明,A1和pppA缺失株中100多个基因的表达水平受到了显著的影响。以上结果表明,溶藻弧菌中T6SS的PppA/PpkAl介导调控多种表型,丰富了我们对新发现的T6SS系统的认识。在胃肠道内,复杂的通信发生在定植的细菌与胃肠道细胞内。这些通信中包括了病原菌和宿主之间的通讯。条件致病菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是众所周知的一种伤口和肺部感染的病原菌。它的毒力与其监控宿主化学信号的能力以及形成生物被膜黏附于表面的能力有关。本探讨通过浅析在环境压力下,由真核细胞水解ATP产生的、随后分泌到胃肠道内的信号分子腺苷对细菌病原性的影响,阐明了腺苷在调控铜绿假单胞菌的病原性中起到的关键作用。外源腺苷的添加抑制了铜绿假单胞菌形成生物被膜的能力,同时腺苷还可以通过抑制鼠李糖脂的产生来减弱细菌爬动的能力。由于腺苷的代谢物肌苷不会影响生物被膜的形成,并且由于腺苷代谢能力的丧失也不会影响细菌的表型,由此推测腺苷代谢物对于铜绿假单胞菌病原性的降低没有显著影响。腺苷还可以降低毒力因子的产生,例如绿脓菌素、弹性蛋白酶、胞外多糖、铁载体和假单胞菌喹诺酮信号,这些毒力因子的减少可以降低铜绿假单胞菌对秀丽隐杆线虫的侵染能力。为了探究腺苷降低铜绿假单胞菌的毒力机制,本探讨采取全基因组转录浅析策略,利用基因芯片技术,浅析了腺苷添加对基因表达的影响。芯片结果显示腺苷的添加抑制了部分基因的表达,与在富含铁离子的环境中得到的结果相似。电泳迁移实验表明,铁相关基因的表达受到了腺苷的抑制,推测这是由于腺苷可以增强铁摄取调节因子Fur与pvdS和fagA等铁相关启动子的结合以而阻碍这些基因的转录。由此,腺苷作为一个跨界信号抑制某些铁摄取基因的表达,降低了铜绿假单胞菌的毒力。本探讨作用在于提出了一个新的无毒的策略(添加腺苷)来抑制生物被膜的形成和降低毒力,并且对于最重要的毒力调节因子之一的Fur蛋白在铜绿假单胞菌中是如何受到制约的这一不论文导读：摘要5-7Abstract7-13第1章文献综述13-301.1海水养殖病原菌溶藻弧菌13-141.2溶藻弧菌的毒力因子和致病机理14-231.2.1胞外蛋白酶141.2.2Ⅵ型分泌系统14-231.2.2.1Ⅵ型分泌系统的结构17-191.2.2.2Ⅵ型分泌系统的表达调控19-211.2.2.3Ⅵ型分泌系统的交互通讯21-231.3群体感应系统23-241.4人类致病菌溶藻
足,提供了一个崭新的理解。关键词：溶藻弧菌论文Ⅵ型分泌系统论文群体感应论文铜绿假单胞菌论文病原性论文
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Abstract7-13
第1章 文献综述13-30

1.1 海水养殖病原菌溶藻弧菌13-14

1.2 溶藻弧菌的毒力因子和致病机理14-23

1.2.1 胞外蛋白酶14

1.2.2 Ⅵ型分泌系统14-23

1.2.2.1 Ⅵ型分泌系统的结构17-19

1.2.2.2 Ⅵ型分泌系统的表达调控19-21

1.2.2.3 Ⅵ型分泌系统的交互通讯21-23

1.3 群体感应系统23-24

1.4 人类致病菌溶藻弧菌24-26

1.5 铜绿假单胞菌中Fur介导的全局调控26-27

1.6 本探讨主要内容及作用27-30

第2章 群体感应系统和RpoN调控溶藻弧菌Ⅵ型分泌系统30-51

2.1 前言30-31

2.2 实验材料31-34

2.1 菌株、质粒和培养条件31

2.2 引物31-34

2.3 主要浅析生物学试剂盒仪器设备34

2.4 蛋白和DNA浅析软件34

2.3 实验策略34-39

2.3.1 大肠杆菌感受态细胞制备及转化34

2.3.

1.1 感受态细胞制备34

2.3.

1.2 感受态细胞转化34

2.3.2 框内无标记缺失突变株的构建34-36

2.3.3 插入失活突变株的构建36

2.3.4 回补菌株的构建36-37

2.3.5 生长曲线测定37

2.3.6 Western blotting蛋白印迹37-38

2.3.6.1 全菌蛋白样品制备37

2.3.6.2 上清中蛋白样品制备37

2.3.6.3 蛋白印迹37-38

2.3.7 实时荧光定量PCR38

2.3.8 运动性浅析38

2.3.9 胞外蛋白酶活性浅析38-39

2.4 实验结果39-47

2.4.1 溶藻弧菌Ⅵ型分泌系统基因簇鉴定39-40

2.4.2 突变株的构建40-41

2.4.3 hcp基因及其编码蛋白的信息学浅析41

2.4.4 Hcp1蛋白的生长依赖型表达41-42

2.4.5 群体感应系统调控Hcp1的表达42-43

2.4.6 RpoN((δ~(54))和VasH调控Hcp1的表达43-45

2.4.7 LuxR、RpoN和VasH调控其他T6SS基因45-46

2.4.8 VasH调控运动性及胞外蛋白酶的活性46-47

2.5 讨论47-49

2.6 本章小结49-51

第3章 Ⅵ型分泌系统调控病原相关表型51-64

3.1 前言51

3.2 实验材料51-54

3.

2.1 菌株、质粒和培养条件51-52

3.

2.2 引物52-54

3.

2.3 主要分子生物学试剂盒仪器设备54

3.3 实验策略54-56

3.1 扫描电镜样品制备55

3.2 生物被膜形成浅析55

3.3 生物聚集55

3.4 胞外蛋白酶活性浅析55-56

3.5 鱼体攻毒实验56

3.4 实验结果56-63

3.4.1 T6SS突变株的扫描电镜56-57

3.4.2 T6SS影响溶藻弧菌的运动性57

3.4.3 T6SS影响溶藻弧菌生物被膜形成及聚集57

3.4.4 T6SS影响溶藻弧菌胞外蛋白酶的形成57-59

3.4.5 T6SSVA1单个基因影响运动性、生物被膜和胞外蛋白酶59-63

3.4.5.1 T6SSVA1单个基因突变株构建59-61

3.4.5.2 T6SSVA1单个基因影响多表型61-63

3.5 讨论63

3.6 本章小结63-64

第4章 PppA/PpkA1调控T6SS、QS和c-di-GMP合成64-84

4.1 前言64

4.2 实验材料64

4.3 实验策略64-67

4.

3.1 c-di-GMP定量浅析66-67

4.

3.2 生物芯片浅析67

4.4 实验结果67-81

4.1 PppA/PpkA1调控Hcp1的表达和分泌67-69

4.4.

1.1 △pppA、△A1和pppA~+突变株的构建67-68

4.4.

1.2 PppA/PpkA1调控Hcp1的表达和分泌68-69

4.4.2 PppA/PpkA1调控Asp的表达69-71

4.3 PppA/PpkA1通过LuxR调控Asp的表达71-72

4.4 PppA/Ppk1论文导读：

A调控多表型72-73

4.5 PppA/PpkA1通过c-di-GMP调控多表型73-75

4.6 PppA和PpkA1缺失株全基因组转录谱浅析75-81

4.5 讨论81-83

4.6 本章小结83-84

第5章 腺苷通过激活Fur来调控铜绿假单胞菌的病原性84-110

5.1 前言84-85

5.2 实验材料85-87

5.

2.1 菌株、质粒和培养条件85-86

5.

2.2 引物86

5.

2.3 主要分子生物学试剂和仪器设备86-87

5.

2.4 浅析软件87

5.3 实验策略87-91
5.

3.1 生物被膜浅析87

5.

3.2 总RNA提取和芯片浅析87

5.

3.3 实时荧光定量PCR87

5.

3.4 爬动性和鼠李糖脂浅析87-88

5.

3.5 毒力因子浅析88

5.

3.6 秀丽隐杆线虫慢性杀伤浅析88

5.

3.7 Fur蛋白的表达和纯化88-89

5.

3.8 电泳迁移浅析89-90

5.

3.9 对接浅析90-91

5.4 实验结果91-107
5.

4.1 腺苷减少铜绿假单胞菌中生物被膜的形成91-93

5.

4.2 腺苷通过减少鼠李糖脂生成来减弱运动性93-96

5.

4.3 腺苷降低多种毒力因子的产生96

5.

4.4 腺苷降低铜绿假单胞菌对线虫的致病性96

5.

4.5 腺苷抑制摄铁相关的调节子96-104

5.

4.6 腺苷影响Fur蛋白结合铁摄取基因104

5.

4.7 腺苷与Fur蛋白结合位点预测104-107

5.5 讨论107-108

5.6 本章小结108-110

第6章 结论和革新点110-113

6.1 主要结论110-111

6.2 论新点111-112

6.3 展望112-113

参考文献113-126
攻读博士学位期间探讨成果126-127
致谢127