阐释铜绿铜绿假单胞菌致病因子抑制剂及喹诺酮信号分子介导调节途径

论文导读：限制了人们治疗细菌感染性疾病的能力,感染性疾病再次对人类健康造成严重的威胁。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)是一种条件致病菌,是医院获得性感染的三大致病菌之一。它能引起各种不同的急性或慢性感染,特别是对于免疫功能缺陷或是患有慢性疾病的人群。抗生素的长期利用及滥用使铜绿假单胞菌对许多抗生素产生了严
摘要：抗生素的利用使细菌感染类疾病得到了有效的制约,但随着耐药菌株的出现限制了人们治疗细菌感染性疾病的能力,感染性疾病再次对人类健康造成严重的威胁。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)是一种条件致病菌,是医院获得性感染的三大致病菌之一。它能引起各种不同的急性或慢性感染,特别是对于免疫功能缺陷或是患有慢性疾病的人群。抗生素的长期利用及滥用使铜绿假单胞菌对许多抗生素产生了严重的耐药性,这导致铜绿假单胞菌感染类疾病在临床治疗中面对了极大的困难。细菌的致病力取决于细菌所产生的致病因子(或毒性因子)极为对宿主的损伤意义。致病菌通过释放毒性因子来破坏宿主细胞的正常生理功能,甚至导致宿主细胞的死亡。由此,通过抑制细菌感染宿主历程中所依赖的毒性因子,将可从抑制细菌的致病性,达到制约感染的目的。由此,对细菌致病途径及机理的探讨,并在此基础上研发抗细菌致病性药物,已成为病原微生物和抗生素探讨领域的一个全新的重要方向。中药在我国具有数千年的历史,其防治感染性疾病的能力被人们所熟知。本课题从中药中“清热解毒”类药材为筛选对象,使用荧光素酶(Luciferase)基因luxCDABE为报道子连接于铜绿假单胞菌毒性相关基因的启动子之后,对致病因子基因进行标记,筛选并探讨中药材中抗致病成分,探索其化学本质极为意义途径与机理。并在此基础上将黄芩苷的意义靶点—喹诺酮信号分子体系(Pseudomonas quinolone signal, PQS)对其所介导的致病因子的调节途径进行了深入的探讨。探讨结果发现中药材黄芩粗提物和艾叶粗提物中有着抗铜绿假单胞菌致病性的成分,在对细菌的生长没有影响的条件下,黄芩粗提物可从显著的抑制铜绿假单胞菌毒性相关基因,其中包括群体感应体系(Quorum sensing, QS)基因lasI、lasR、rhlI和rhlR,Ⅲ型分泌体系基因exoS和运动相关基因filC的表达。而艾叶水提物可从抑制lasR、rhlI、 rhlR、exoS和filC的表达。且黄芩和艾叶粗提物均对铜绿假单胞菌丛动能力有显著的抑制意义。进一步的探讨发现,黄芩中含有的化学成分之一黄芩苷可从显著抑制铜绿假单胞菌毒性因子如Ⅲ型分泌体系、QS相关表型如鼠李糖脂、弹性蛋白酶从及细菌的丛动能力。结果表明黄芩苷很可能是黄芩抑制铜绿假单胞菌致病性的主要成分。本课题从黄芩苷对Ⅲ型分泌体系中效应蛋白基因exoS的表达抑制为线索,进一步探讨了黄芩苷对铜绿假单胞菌致病因子的意义途径和意义机理。在已知的致病因子全局调控体系的突变体中检测了黄芩苷对exoS表达抑制意义的变化,结果证明黄芩苷的意义依赖于PQS群体感应体系,它对致病因子的调节意义是通过这一途径来实现的。在PQS信号分子产生相关的pqsH基因突变体及调控蛋白PqsR (信号分子PQS的同源受体)突变菌株中,黄芩苷对exoS表达抑制意义消失。当PQS与PqsR蛋白共同有着的条件下,黄芩苷对Ⅲ型分泌体系的抑制意义即可恢复。但只有PQS信号分子前体HHQ与PqsR蛋白有着或者是只有PqsR蛋白本身有着的条件下,黄芩苷对Ⅲ型分泌体系的抑制意义不能恢复,这表明黄芩苷对Ⅲ型分泌体系的抑制意义是PQS与PqsR共同介导的。探讨还发现,黄芩苷可从使铜绿假单胞菌产生一个胞外未知物质。通过高效液相及质谱分析,初步确定了此物质的几点化学性质,此物质的极性性质类似于信号分子PQS,但并不是PQS信号分子。实验还发现铜绿假单胞菌产生此物质不需要PQS体系中的调控蛋白PqsR,推测此未知物质的产生可能与黄芩苷抗致病的意义机制有关。使用体外小鼠细胞EMT6毒性、果蝇感染模型从及大鼠海藻包埋肺部感染模型,实验探讨了黄芩苷对铜绿假单胞菌体内致病性的影响。细胞毒性实验从及果蝇感染实验,同时证明黄芩苷可从显著削弱铜绿假单胞菌PAO1的致病性。在进一步的动物肺炎模型实验中,通过大鼠肺组织病理分级、血清中炎症因子TNF-α含量从及肺组织内活菌计数等多项指标检测,结果证明黄芩苷除抑制铜绿假单胞菌致病因子外,可从减少机体炎症反应并加速大鼠对细菌的清除。这些结果表明黄芩苷是一个具有良好前景的、有效治疗铜绿假单胞菌感染的抗致病药物候选体。针对黄芩苷意义靶点-PQS群体感应调节体系的进一步探讨结果表明,此体系信号分子PQS对铜绿假单胞菌生物被膜的形成有重论文导读：.1.5铜绿假单胞菌的耐药机制26-291.1.6铜绿假单胞菌群体感应体系及致病性29-311.1.7铜绿假单胞菌喹诺酮类信号分子31-331.2抗感染中药33-341.3探讨目的和作用34-35第二章实验材料和办法35-502.1实验材料35-392.1.1菌株及质粒35-372.1.2实验动物372.1.3培养基及培养条件37-382.1.4实验试剂及配置38-392.1.5实验仪
要的影响,同时对其丛动能力具有显著的抑制意义。本探讨证明PQS对丛动能力的抑制意义不依赖于调控蛋白PqsR的有着；也与细菌鞭毛、菌毛的形成从及表面活性剂鼠李糖脂的产量变化无关。以实验结果发现铜绿假单胞菌的蹭行运动不受到PQS的调控,但却依赖于调控蛋白PqsR的有着。这一探讨结果首次揭示了铜绿假单胞菌中喹诺酮信号分子对致病因子的调节是可从通过PqsR依赖和PqsR非依赖两种途径实现。与先前文献报道有所不同,本探讨还发现PQS对铜绿假单胞菌生物被膜的推动与Las和Rhl体系的调节机制无关,而是依赖于GacAS/R调控途径。探讨还发现,PQS在突变体gacA中对铜绿假单胞菌丛动的抑制意义仍然有着,这表明了信号分子PQS对丛动能力的抑制和对生物被膜的增强意义是通过不同的机制来调控的。关键词：铜绿假单胞菌论文毒性因子论文黄芩苷论文Ⅲ型分泌体系论文丛动论文喹诺酮类信号分子生物被膜论文
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ABSTRACT6-9
目录9-15
第一章 绪论15-35

1.1 铜绿假单胞菌15-33

1.1 铜绿假单胞菌的致病机理15-17

1.2 铜绿假单胞茵Ⅲ型分泌体系17-22

1.3 铜绿假单胞菌生物被膜22-24

1.4 铜绿假单胞菌运动性24-26

1.5 铜绿假单胞菌的耐药机制26-29

1.6 铜绿假单胞菌群体感应体系及致病性29-31

1.7 铜绿假单胞菌喹诺酮类信号分子31-33

1.2 抗感染中药33-34

1.3 探讨目的和作用34-35

第二章 实验材料和办法35-50

2.1 实验材料35-39

2.

1.1 菌株及质粒35-37

2.

1.2 实验动物37

2.

1.3 培养基及培养条件37-38

2.

1.4 实验试剂及配置38-39

2.

1.5 实验仪器39

2.2 实验办法39-50

2.1 中药粗提物的制备39-40

2.2 层培养基扩散法及半固体混药法检测基因表达40-41

2.3 基因表达液体检测法(酶标检测仪)41-42

2.4 细菌运动性检测42

2.5 生物被膜(biofilm)的测定42-43

2.6 弹性蛋白酶检测43

2.7 浓硫酸-地衣酚法测定鼠李糖脂含量及活性43-44

2.8 细胞毒性检测44

2.9 果蝇感染模型44-45

2.10 铜绿假单胞菌藻酸盐包埋颗粒的制备45-46

2.11 大鼠肺部感染操作步骤46

2.12 感染大鼠给药分组46

2.13 肉眼观测大鼠肺部感染分级46-47

2.14 大鼠肺病理切片制作47

2.15 大鼠血清样本的采集和制备(ELISA法检测大鼠血清中TNF-α浓度)47

2.16 大鼠肺组织中活菌计数47-48

2.17 双亲株杂交将启动子.报道子序列整合于染色体48

2.18 PQS提取及薄层层析检测48-49

2.19 薄层层析所分离物质的刮板及浓缩49

2.20 高效液相(HPLC)分析49

2.21 质谱分析49-50

第三章 实验结果50-86

3.1 20 种中药粗提物对铜绿假单胞菌毒性因子表达的影响50-52

3.

1.1 中药粗提库的构建50

3.

1.2 中药对铜绿假单胞菌毒性因子表达的影响50-52

3.2 艾叶对铜绿假单胞菌毒性因子表达的影响52-54
3.

2.1 艾叶水提物抑制铜绿假单胞菌毒性因子的表达52-53

3.

2.2 艾叶水提物抑制铜绿假单胞菌的丛动能力53-54

3.3 黄芩粗提物对铜绿假单胞菌毒性因子表达的影响54-57

3.1 黄芩粗提物对铜绿假单胞菌毒性因子表达的影响54-56

3.2 黄芩粗提物抑制铜绿假单胞菌丛动能力56-57

3.4 黄芩有效成分黄芩苷对铜绿假单胞致病性的抑制57-69

3.4.1 黄芩苷对铜绿假单胞菌毒性因子表达的影响57-60

3.4.2 黄芩苷显著抑制细菌铜绿假单胞菌丛动能力60

3.4.3 黄芩苷抑制弹性蛋白酶从及鼠李糖脂的合成60-62

3.4.4 黄芩苷削弱铜绿假单胞菌对真核细胞的细胞毒性62-63

3.4.5 果蝇感染模型中黄芩苷对铜绿假单胞菌致病性的抑制63-64

3.4.论文导读：

6 大鼠肺部感染模型中黄芩苷对铜绿假单胞菌致病性的抑制64-69

3.5 黄芩苷抑制铜绿假单胞菌致病性的意义机制探讨69-78

3.5.1 GacA途径与黄芩苷的意义69-70

3.5.2 Rh1R/I--HSL体系与黄芩苷的意义70

3.5.3 黄芩苷从PQS体系为靶点来抑制Ⅲ型分泌体系的表达70-75

3.5.4 黄芩苷对铜绿假单胞菌丛动能力的抑制意义与调控蛋白PqsR无关75-76

3.5.5 黄芩苷对PQS体系信号分子产生的影响76-77

3.5.6 未知物质的提取分离及鉴定77-78

3.6 铜绿假单胞菌PQS群体感应调节体系对致病因子调节途径的探讨78-86

3.6.1 PQS可抑制细菌丛动能力,此抑制意义不依赖于调控蛋白PqsR的有着78-80
3.6.2 PAO1蹭行运动需要调控蛋白PqsR的有着；PQS信号分子及调控蛋白PqsR对PAO1的泳动能力没有影响80

3.6.3 外加PQS对影响铜绿假单胞菌运动相关基因的影响80-82

3.6.4 PQS对铜绿假单胞菌生物被膜的推动意义不依赖于Las和Rhl体系82-83
3.6.5 PQS对铜绿假单胞菌生物被膜的推动意义依赖于RetS/GacAS/R体系83-86
第四章 讨论86-94

4.1 中药中抗致病性成分的筛选86

4.2 黄芩苷抗致病因子的意义机制探讨86-88

4.3 黄芩苷抑制铜绿假单胞菌丛动能力的探讨88-89

4.4 PQS信号分子及调控蛋白PqsR对铜绿假单胞菌运动性的影响89-90

4.5 铜绿假单胞菌信号分子PQS推动生物被膜形成的机制探讨90-92

4.6 小结92-94

参考文献94-107
攻读博士学位期间取得的探讨成果107-108
致谢108-109
作者介绍109