试论免疫相关基因多态与扇贝抗病性关联网

论文导读：PCR-RFLP和TetraARMsPCR等策略探讨了CfPGRP、CfLGBP、AiSPI和AiDef基因多态性及其与扇贝对鳗弧菌抗性/敏感性的联系。肽聚糖识别蛋白（PGRP）和脂多糖和β-1,3-葡聚糖结合蛋白（CfLGBP）作为方式识别受体，在固有免疫中发挥重要作用。本探讨对栉孔扇贝CfPGRP和CfLGBP的基因多态性及其与扇贝对鳗弧菌的抗性进行了关联浅析。在CfL
摘要：水产养殖为世界提供了将近三分之一的食物，其中软体动物养殖产量在全球水产养殖中居第二位，80%-90%来自中国和日本。栉孔扇贝和海湾扇贝是中国重要的养殖品种，但是在过去的几十年间，由于频繁爆发的疾病使中国的扇贝养殖业遭受了巨大的经济损失，由此有必要通过分子手段加速抗病品种的培育步伐。标记辅助育种（marker assisted selection，MAS）是成功运用于动物育种中的分子手段之一，但由于缺乏与抗病性状相关的标记，MAS目前还无法在软体动物中得到运用。由此，寻找与抗病性状相关的分子标记是在软体动物中进展MAS的关键。本探讨利用鳗弧菌（Listonella anguillarum）对栉孔扇贝和海湾扇贝进行攻毒感染实验，初步得到敏感群体和抗病群体后采取PCR、PCR-RFLP和Tetra ARMs PCR等策略探讨了CfPGRP、CfLGBP、AiSPI和AiDef基因多态性及其与扇贝对鳗弧菌抗性/敏感性的联系。肽聚糖识别蛋白（PGRP）和脂多糖和β-1,3-葡聚糖结合蛋白（CfLGBP）作为方式识别受体，在固有免疫中发挥重要作用。本探讨对栉孔扇贝CfPGRP和CfLGBP的基因多态性及其与扇贝对鳗弧菌的抗性进行了关联浅析。在CfLGBP和CfPGRP基因中分别发现8个和12个多态性位点，其中CfLGBP的脂多糖和葡聚糖结合蛋白基序中有两个非同义突变（+4407位点和+4408位点），而在CfPGRP的肽聚糖识别蛋白结合基序中有一个非同义突变（+7679）。这三个位点在抗病群体和敏感群体中的分布有着显著性差别（P 0.05），CfPGRP基因的+4407CT基因型和+4408G/A基因型，CfLGBP基因的+7679G/G基因型与栉孔扇贝对鳗弧菌的抗性相关。为了验证这个结果，利用酶联免疫吸附实验分别检测了LPS, PGN和β-glucan与不同基因型的PGRP和LGBP蛋白间的结合活性。结果表明，两种基因型的蛋白与相应配体的结合活性具有显著性差别（P 0.05）。另外检测了不同基因型的PGRP的抗菌活性，尽管两种基因型的PGRP都能抑制大肠杆菌的生长，但两种之间无显著性差别（P0.05）。总之，CfPGRP基因的+4407CT基因型和+4408G/A基因型，CfLGBP基因的+7679G/G基因型与栉孔扇贝对鳗弧菌的抗性相关。CfPGRP和CfLGBP基因多态影响了病原相关分子方式的结合活性，但并没有影响抗菌活性。这些结果表明这3个位点可以作为潜在的分子标记运用于扇贝抗病育种中。同时，我们检测了AiSPI和AiDef基因部分序列的多态性，并对其与抗病性的联系进行了探讨。在AiSPI基因中找到9处SNPs位点，其中5处为非同义突变；在获得的AiDef基因部分序列中没有发现多态性位点。选取AiSPI基因的两处多态性位点，+536和+1312进行抗病相关性浅析。结果表明+536A-G多态性位点与扇贝对鳗弧菌的抗性/敏感性显著相关，+536A/A基因型在抗病群体中的分布显著高于敏感群体（P 0.05）；而+1312C-T位点与与扇贝对鳗弧菌的抗性/敏感性不相关（P0.05）。具有+536A/A基因型的AiSPI基因编码的蛋白，rAiSPI (N)具有较强的体外丝氨酸蛋白酶活性（P 0.05）。但这个结果仍需要进一步的体内实验来证实。这些结果将为贝类的标记辅助育种提供参考。此外，抗病相关分子标记的发现还有利于加深对扇贝发病机理的理解，并有助于发掘预防及治疗贝类疾病的新策略。关键词：
【学位授予单位】：论文中国科学院探讨生院（海洋探讨所）
【学位级别】：论文博士
【学位授予年份】：论文2012
【分类号】：论文S944.3
【目录】：论文Acknowledgements4-7
中文摘要7-9
ABSTRACT9-16
CHAPTER Ⅰ - Literature Review16-38

1. Disease resistance and immunity17-26

1. Defining disease17-18

1.2. The mechani of resistance18-22

1.3. The geneti论文导读：ialchallenge43-443.2ExtractionofgenomicDNA44-61SectionⅢ-Experimentalresults61-751ThescallopSusceptibleandresistantstocks612ThefeaturesandstructuralorganizationCfPGRPgenomicDNA61-66olymorphisofPGRPdomainregionofCfPGRP-S15166-684TheassociationbetweenCG/TApolymor
c basis of disease resistance22-26
2. The breeding of disease resistant strains26-31
2.

1. Direct selection28

2.2. Indirect selection28-30

2.3. Transgenic method30-31

2.4. Marker assisted selection31

3. Progress in disease resistant breeding31-36
3.1. Progress in pvestock and poultry disease resistant breeding32-34
3.2. Aquatic animal disease resistance breeding research34-36

4. Challenges and opportunities36-37

4.1 Challenges36

4.2 Opportunities36-37

5. Objectives and Significance of the study37-38
CHAPTER Ⅱ - CfPGRP gene polymorphi and its association with disease resistance/susceptibipty in scallop38-78
Section Ⅰ - Introduction38-40
Section Ⅱ - Materials and methods40-61

1. Chemicals and equipments40-41

2 Preparation of reagents and culture media41-43
3 Experimental methods43-61

3.1 Scallops and Bacterial challenge43-44

3.2 Extraction of genomic DNA44-61

Section Ⅲ - Experimental results61-75
1 The scallop Susceptible and resistant stocks61
2 The features and structural organization CfPGRP genomic DNA61-66
3 Polymorphis of PGRP domain region of CfPGRP-S15166-68
4 The association between CG/TA polymorphi and disease resistance/susceptibipty68-71
5 In vitro Functional capabipties of protein variants71-75
Section Ⅳ - Discussion and Conclusion75-78
CHAPTER Ⅲ - CfLGBP gene polymorphi and its association with disease resistance/susceptibipty in scallop78-101
Section Ⅰ - Introduction78-80
Section Ⅱ - Materials and methods80-85
1 Chemical reagents and equipments80
2 Reagent preparations80
3 Experimental methods80-85
Section Ⅲ - Experimental results85-98
1 The scallop Susceptible and resistant stocks85
2 CfLGBP genomic DNA structural organization85-90
3 The polymorphis in the LPS and glucanase binding domain of CfLGBP domain90-92
4 Association of SNP +7679 G-A with disease resistance/susceptibipty of scal论文导读：scallop101-123SectionⅠ-Introduction101-103SectionⅡ-Materialsandmethods103-1081Chemicalreagentsandequipments1032Reagentpreparations1033Experimentalmethods103-108SectionⅢ-Experimentalresults108-1171Susceptibleandresistantbayscallopstocks1082AiSPI,AiDefdomaingenomicDN
lops92-94
5 Invitro Functional assays for protein variants94-98
Section Ⅳ - Discussion and Conclusion98-101
CHAPTER Ⅳ - Bay scallop Serine protease inhibitor, Defensin gene polymorphi and its association with disease resistance/susceptibipty in scallop101-123
Section Ⅰ - Introduction101-103
Section Ⅱ - Materials and methods103-108
1 Chemical reagents and equipments103
2 Reagent preparations103
3 Experimental methods103-108
Section Ⅲ - Experimental results108-117
1 Susceptible and resistant bay scallop stocks108
2 AiSPI, AiDef domain genomic DNA structural organization108-111
3 AiSPI gene polymorphi111-112
4 Association of SNP +536, +1312 with disease resistance/susceptibipty of scallops112-116
5 In vitro functional capabipty of protein variants116-117
Section Ⅲ – Discussion and Conclusion117-122
CHAPTER Ⅴ – Conclusion122-123
References123-144
Pubpcations144-145