浅议抗原SjTPx-3基因克隆、特性及免疫保护效果评估
最后更新时间：2024-03-29
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论文导读：良好的免疫原性和抗原性。运用实时定量PCR和Westernblotting浅析SjTPx-3基因在虫体中不同发育阶段转录和表达情况,结果表明其在虫体中各个时期都有表达,且35d虫体中表达量高于其他时期；利用免疫组化策略观察SjTPx-3蛋白在虫体中分布情况,结果表明,SjTPx-3在日本血吸虫体被表膜和实质组织中均有分布。首次在被金属催化的氧化
摘要：血吸虫病(Schistosomiasis)是由血吸虫(Schistosome)感染引起的一种危害严重的人畜共患寄生虫病。尽管近年来采取了大量抗血吸虫药物治疗和其他一些防控措施,但由于中间宿主钉螺、牛等保虫宿主难以制约以及药物不能防止再感染等理由,血吸虫病仍是一个重要的公共卫生不足。探讨开发高效、具有明确保护作用的抗血吸虫疫苗是目前血吸虫病防控探讨中的热点之一。本探讨室在不同宿主来源日本血吸虫蛋白质组探讨中发现,日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(schistosoma japonicum thioredoxin peroxidase Ⅲ, SjTPx-3)在血吸虫不适宜宿主大鼠来源虫体中的表达量比小鼠来源虫体显著增加,而且在血吸虫表膜蛋白质组浅析中也发现该分子,推测其可能在血吸虫生长发育历程和对抗宿主的免疫攻击中具有重要作用。本论文探讨了SjTPx-3基因的转录及其表达部位,在大肠杆菌中表达纯化到重组抗原,评估了免疫保护效果,初步浅析其免疫应答机制,验证了生物学功能,为评估其成为疫苗的抗原候选分子或作为药物靶标的潜力提供了一定的基础。本论文根据GenBank中SjTPx-3基因序列,设计特异引物,利用PCR技术以日本血吸虫42d成虫cDNA中扩增得到特异的DN段。测序结果表明其为SjTPx-3的ORF片段,长度为663bp,编码221个氨基酸,与SmTPx-3同源性达到90%以上。编码蛋白论述分子量为24996.86Da,等电点为8.237,生物信息学浅析显示该蛋白二级结构主要为超螺旋,亲水性较差,无信号肽,50-80位氨基酸可能为跨膜区,具有较强的抗原性。进一步利用BamH I Xho I将SjTPx-3基因片段定向克隆至pET28a(+)、 pET32a(+),成功构建了重组表达质粒PET28a(+)-SjTPx-3和pET32a(+)-SjTPx-3,并在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式纯化得到重组蛋白,分子量分别为29KDa和42KDa。将重组蛋白免疫小鼠,收集血清。Western blotting浅析结果表明两种重组蛋白能被日本血吸虫成虫粗抗原血清和重组蛋白免疫血清识别,说明具有良好的免疫原性和抗原性。运用实时定量PCR和Western blotting浅析SjTPx-3基因在虫体中不同发育阶段转录和表达情况,结果表明其在虫体中各个时期都有表达,且35d虫体中表达量高于其他时期；利用免疫组化策略观察SjTPx-3蛋白在虫体中分布情况,结果表明,SjTPx-3在日本血吸虫体被表膜和实质组织中均有分布。首次在被金属催化的氧化作用系统(MCO)中检测了SjTPx-3的抗氧化活性,结果表明SjTPx-3在体外能够发挥抗氧化物酶活性,能抵抗游离氧的作用。大量纯化制备pET28a(+)-SjTPx-3和pET32a(+)-SjTPx-3两种重组抗原,结合ISA206佐剂免疫BALB/c小鼠,分别进行小鼠日本血吸虫病免疫保护试验,结果和空白对照组比较,rpET28a(+)-SjTPx-3在BALB/c小鼠中分别诱导了13.04%的减虫率和31.21%(P0.05)的肝脏减卵率,rpET32a(+)-SjTPx-3诱导了37.02%(P0.05)的减虫率、56.52%(P0.05)的肝脏减卵率。免疫保护机制探讨表明,运用重组抗原三次免疫后,免疫鼠血清中特异性的IgG1和IgG2a抗体水平都持续升高,但IgGl/IgG2a比值逐渐上升,同时,三免后小鼠血清中产生了高滴度的IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-g,说明rSjTPx-3免疫小鼠后诱导了Th1/Th2混合型免疫应答但以Th2型占主导。结果提示,SjTPx-3重组蛋白可诱导小鼠产生显著的保护作用,是一种有潜力的抗血吸虫病候选疫苗分子。本论文较系统地开展了日本血吸虫SjTPx-3探讨,对了解SjTPx-3的特性和筛选血吸虫病疫苗新候选抗原分子具有重要作用。关键词：SjTPx-3论文克隆论文表达特性论文疫苗候选抗原分子论文免疫机制论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要4-6
Abstract6-8
目录8-10
前言10-22
血吸虫病疫苗的探讨进展11-22
1 血吸虫病疫苗12-18
2 血吸虫病疫苗探讨面对的不足和展望18-19
3 血吸虫相关氧化还原酶类蛋白的探讨19-20
4 结语20-22
第二篇 试验探讨22-48
第一章 SjTPx-3基因克隆及表达特性浅析22-34
1 试验材料23-24
2 试验策略24-26
3 试验结果26-32
4 讨论32-34
第二章 SjTPx-3重组蛋白的表达及鉴定34-48
1 试验材料34-36
2 试验策略36-41
3 试验结果41-46
4 小结46-48
第三章 日本血吸虫重组SjTPx-3蛋白的小鼠免疫保护机制的初步探讨48-55
1 试验材料48
2 试验策略48-49
3 实验结果49-53
4 小结53-55
全文总结55-56
参考文献56-63
英文缩略表63-65
致谢65-66
作者介绍66
摘要：血吸虫病(Schistosomiasis)是由血吸虫(Schistosome)感染引起的一种危害严重的人畜共患寄生虫病。尽管近年来采取了大量抗血吸虫药物治疗和其他一些防控措施,但由于中间宿主钉螺、牛等保虫宿主难以制约以及药物不能防止再感染等理由,血吸虫病仍是一个重要的公共卫生不足。探讨开发高效、具有明确保护作用的抗血吸虫疫苗是目前血吸虫病防控探讨中的热点之一。本探讨室在不同宿主来源日本血吸虫蛋白质组探讨中发现,日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(schistosoma japonicum thioredoxin peroxidase Ⅲ, SjTPx-3)在血吸虫不适宜宿主大鼠来源虫体中的表达量比小鼠来源虫体显著增加,而且在血吸虫表膜蛋白质组浅析中也发现该分子,推测其可能在血吸虫生长发育历程和对抗宿主的免疫攻击中具有重要作用。本论文探讨了SjTPx-3基因的转录及其表达部位,在大肠杆菌中表达纯化到重组抗原,评估了免疫保护效果,初步浅析其免疫应答机制,验证了生物学功能,为评估其成为疫苗的抗原候选分子或作为药物靶标的潜力提供了一定的基础。本论文根据GenBank中SjTPx-3基因序列,设计特异引物,利用PCR技术以日本血吸虫42d成虫cDNA中扩增得到特异的DN段。测序结果表明其为SjTPx-3的ORF片段,长度为663bp,编码221个氨基酸,与SmTPx-3同源性达到90%以上。编码蛋白论述分子量为24996.86Da,等电点为8.237,生物信息学浅析显示该蛋白二级结构主要为超螺旋,亲水性较差,无信号肽,50-80位氨基酸可能为跨膜区,具有较强的抗原性。进一步利用BamH I Xho I将SjTPx-3基因片段定向克隆至pET28a(+)、 pET32a(+),成功构建了重组表达质粒PET28a(+)-SjTPx-3和pET32a(+)-SjTPx-3,并在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式纯化得到重组蛋白,分子量分别为29KDa和42KDa。将重组蛋白免疫小鼠,收集血清。Western blotting浅析结果表明两种重组蛋白能被日本血吸虫成虫粗抗原血清和重组蛋白免疫血清识别,说明具有良好的免疫原性和抗原性。运用实时定量PCR和Western blotting浅析SjTPx-3基因在虫体中不同发育阶段转录和表达情况,结果表明其在虫体中各个时期都有表达,且35d虫体中表达量高于其他时期；利用免疫组化策略观察SjTPx-3蛋白在虫体中分布情况,结果表明,SjTPx-3在日本血吸虫体被表膜和实质组织中均有分布。首次在被金属催化的氧化作用系统(MCO)中检测了SjTPx-3的抗氧化活性,结果表明SjTPx-3在体外能够发挥抗氧化物酶活性,能抵抗游离氧的作用。大量纯化制备pET28a(+)-SjTPx-3和pET32a(+)-SjTPx-3两种重组抗原,结合ISA206佐剂免疫BALB/c小鼠,分别进行小鼠日本血吸虫病免疫保护试验,结果和空白对照组比较,rpET28a(+)-SjTPx-3在BALB/c小鼠中分别诱导了13.04%的减虫率和31.21%(P0.05)的肝脏减卵率,rpET32a(+)-SjTPx-3诱导了37.02%(P0.05)的减虫率、56.52%(P0.05)的肝脏减卵率。免疫保护机制探讨表明,运用重组抗原三次免疫后,免疫鼠血清中特异性的IgG1和IgG2a抗体水平都持续升高,但IgGl/IgG2a比值逐渐上升,同时,三免后小鼠血清中产生了高滴度的IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-g,说明rSjTPx-3免疫小鼠后诱导了Th1/Th2混合型免疫应答但以Th2型占主导。结果提示,SjTPx-3重组蛋白可诱导小鼠产生显著的保护作用,是一种有潜力的抗血吸虫病候选疫苗分子。本论文较系统地开展了日本血吸虫SjTPx-3探讨,对了解SjTPx-3的特性和筛选血吸虫病疫苗新候选抗原分子具有重要作用。关键词：SjTPx-3论文克隆论文表达特性论文疫苗候选抗原分子论文免疫机制论文
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Abstract6-8
目录8-10
前言10-22
血吸虫病疫苗的探讨进展11-22
1 血吸虫病疫苗12-18
2 血吸虫病疫苗探讨面对的不足和展望18-19
3 血吸虫相关氧化还原酶类蛋白的探讨19-20
4 结语20-22
第二篇 试验探讨22-48
第一章 SjTPx-3基因克隆及表达特性浅析22-34
1 试验材料23-24
2 试验策略24-26
3 试验结果26-32
4 讨论32-34
第二章 SjTPx-3重组蛋白的表达及鉴定34-48
1 试验材料34-36
2 试验策略36-41
3 试验结果41-46
4 小结46-48
第三章 日本血吸虫重组SjTPx-3蛋白的小鼠免疫保护机制的初步探讨48-55
1 试验材料48
2 试验策略48-49
3 实验结果49-53
4 小结53-55
全文总结55-56
参考文献56-63
英文缩略表63-65
致谢65-66
作者介绍66