浅论分枝分枝杆菌噬菌体生物学特性及基因组学站

论文导读：y1、Chy3、Chy4和Chy5噬菌体头部均为多面立体对称，而Chy2噬菌体头部呈椭圆形。5株噬菌体均具有长尾，可弯曲，但不可收缩，可见尾板和尾丝，依据ICTV第八次报告的最新病毒分类系统的标准属长尾噬菌体科(Siphoviridae)。3.2Chy1最佳MOI为1.4×10~-6，Chy~2最佳MOI为9.58×10~-5，Chy3最佳MOI为1.1×10~-4，Chy4最佳MOI为

4.5×10~-5，Chy5最

摘要：目的结核病疫情严峻，耐药率高，新型抗结核药物研发越来越困难，分枝杆菌噬菌体逐渐成为新型抗结核药物的探讨热点之一。目前还无文献报道在国内发现新分枝杆菌噬菌体，本探讨在国内首次分离鉴定出5株分枝杆菌噬菌体(Mycobacterium Phage)，命名为Chy1、Chy2、Chy3、Chy4和Chy5，通过对其生物学特性和基因组学进行探讨，探寻这5株分枝杆菌噬菌体抗结核菌的潜力，明确其遗传背景，为噬菌体的进一步开发利用提供论述基础和策略指导。策略1采取直接分离法和富集法以泥土标本中分离、纯化分枝杆菌噬菌体。2比较噬菌体滴度测定、噬菌体大量扩增和收获的不同策略，优化实验条件。3分枝杆菌噬菌体生物学特性探讨3.1采取PEG8000沉淀法纯化分枝杆菌噬菌体，电镜观察噬菌体形态特点。3.2以不同MOI扩增分枝杆菌噬菌体，根据扩增后的产量找出每株噬菌体的最佳MOI。3.3通过一步生长实验测定分枝杆菌噬菌体潜伏期、裂解期和裂解量。3.4分离临床病原菌，用罗氏药敏培养基进行初步菌种鉴定和药敏实验，再采取单斑法测定分枝杆菌噬菌体的宿主谱。3.5比较分枝杆菌噬菌体在pH值为5.0和7.4的7H9固体培养基中裂解耻垢分枝杆菌mc2155的能力。3.6比较Chy1、Chy2、Chy3、D294种噬菌体组成鸡尾酒制剂与这4种噬菌体分别单独裂解耻垢分枝杆菌mc2155的能力，实验数据采取SPSS17.0统计软件中的单因素方差浅析进行统计浅析，以P 0.05为差别有统计学作用。3.7培养原代巨噬细胞，巨噬细胞吞噬结核菌后分为3组，1组加入Chy3，2组加入D29，3组为不加噬菌体的空白对照组，培养过夜后，收集细胞，电镜观察噬菌体对巨噬细胞胞内结核菌的影响。4分枝杆菌噬菌体全基因组测序4.1用λ噬菌体DNA提取试剂盒提取分枝杆菌噬菌体基因组DNA，限制性内切酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。4.2基于鸟法随机测序和重叠群组装的策略进行测序：构建文库，随机挑取克隆片段测序，拼接成大小不一的重叠群，最后通过PCR法填补各重叠群之间的缺口，得到完整的全基因组序列。4.3组装成环形的噬菌体采取DNAStar程序包中的GeneQuest软件对其基因组列进行电子酶切浅析，并与实际酶切图谱进行比较，以确定噬菌体基因组是否为环形。5分枝杆菌噬菌体基因组生物信息学浅析5.1分枝杆菌噬菌体基因预测及基因组注释⑴浅析5株分枝杆菌噬菌体基因组的一般特性：①采取DNAStar软件包中Editseq软件浅析基因组大小，碱基组成，基因平均长度、基因密度以及5株噬菌体遗传子的利用频率及其偏嗜性。②采取TRF软件预测基因组中的串联重复序列。③通过tRNAscan软件预测基因组中的tRNA区域。⑵采取Gpmmer3.0和GeneMark基因预测软件对基因组进行基因de novo预测，推定5株分枝杆菌噬菌体基因组编码序列。⑶用Blast和Clustal软件将推定基因与nr，swissport，tremble，cog数据库中的序列进行同源比对，E value为1e-5，对每个预测出来的基因选取同源比对上分值最高的序列，预测基因功能。6分枝杆菌噬菌体比较基因组学6.1将5个分枝杆菌噬菌体的基因与公共数据库数据进行Blast m8比对，e-value =1e-5，选取每个蛋白的最好比对结果，将两两比对均是最好的结果保留，绘制共线性图。6.2先将所有的基因序列用Clustal W软件进行两两比对，计算得到包含每对序列分歧程度的距离矩阵，再根据距离矩阵计算得到引导树，最后根据前面得到的引导树分支顺序，逐级比对，得到全部序列的全局比对结果，用tree view软件生成进化树。结果1采取富集法分离纯化得到5株分枝杆菌噬菌体,根据分离地点分别命名为Chy1、Chy2、Chy3、Chy4和Chy5。这5株噬菌体的噬菌斑均为圆形、透明、清晰，呈裂解性噬菌体噬菌斑特点，但Chy2、Chy4和Chy5培养超过48h后噬菌斑逐渐变混浊。2优化实验策略，后续实验均采取小平板法测定噬菌体滴度，双层固体培养基培养的策略大量扩增噬菌体以及刮取上层培养基离心的策略收集噬菌体。3分枝杆菌噬菌体生物学特性探讨3.1Chy1、Chy3、Chy4和Chy5噬菌体头部均为多面立体对称，而Chy2噬菌体头部呈椭圆形。5株噬菌体均具有长尾，可弯曲，但不可收缩，可见尾板和尾丝，依据ICTV第八次报告的最新病毒分类系统的标准属长尾噬菌体科(Siphoviridae)。3.2Chy1最佳MOI为1.4×10~-6，Chy~2最佳MOI为9.58×10~-5，Chy3最佳MOI为1.1×10~-4，Chy4最佳MOI为4.5×10~-5，Chy5最佳MOI为1.8×10~-5，后续实验大量扩增这些噬菌体时，均根据最佳MOI扩增，以达到最大产量。3.3Chy~2感染耻垢分枝杆菌mc~2155的潜伏时间约为210min，裂解期为60min，270min后进入平台期，噬菌体滴度不再增加，裂解量为23；Chy3感染耻垢分枝杆菌mc~2155的潜伏时间约为150min，裂解期为90min，240min后进入平台期，噬菌体滴度不再增加，裂解量为40；Chy1、Chy4和Chy5潜伏期超过420min。3.4共收集临床病原菌36株，经菌种鉴定，有32株为结核分枝杆菌(结核菌)，2株为牛结核分枝杆菌，2株为非结核分枝杆菌。这5株分枝杆菌噬菌体的宿主谱较广，能裂解MS mc2155、结核菌标准株H37Rv、大部分临床分离耐药结核菌株、耐药牛结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，其中Chy1对广泛耐药结核菌裂解率达100％。3.5抗菌能力最强的噬菌体是D29(P 0.05)，48h内几乎裂解所有的耻垢分枝杆菌mc~2155，48h后细菌数量逐渐回升，但仍比初始加入的细菌数少，维持在较低水平，其次是鸡尾酒制剂，24h内能裂解大多数耻垢分枝杆菌mc2155，但24h后细菌数逐渐增加，到96h时细菌数与Chy2和Chy3组已无差别(P0.05)。C论文导读：、GL10、GL12、GL13、GL20、GL23、GL24和G上一页123下一页
hy1、Chy2和Chy33个新分离的噬菌体中，Chy3早期(48h)杀菌能力最强(P 0.05)，但到96h时细菌数与Chy2相当(P0.05)，Chy1杀菌能力最弱，在48h内不能抑制细菌生长，但48h后MS不再增加，维持在109CFU左右，细菌数比空白对照组少(P 0.05)。3.6当7H9固体培养基pH值为5.0和7.4时，Chy1、Chy2和Chy3均能裂解耻垢分枝杆菌mc~2155。3.7电镜观察发现Chy3组和D29组结核菌数量少，菌体结构显著被破坏，而空白对照组结核菌数量较多，细菌结构仍完整。4分枝杆菌噬菌体全基因组测序4.15株噬菌体基因组DNA均可被EcoRⅠ、Hind Ⅲ和BamH I切开，这3种核酸内切酶均能识别并切割双链DNA分子特定的核苷酸序列，表明这5株噬菌体基因组均为双链DNA。浅析酶切图谱发现这5株噬菌体基因组大小均在40-50kb之间。4.25株噬菌体测序质量达到完成图标准。Chy1、Chy2、Chy4和Chy5最终均组装为线状重叠群。虽然Chy3组装为环状重叠群，但实际酶切图谱中，Hind Ⅲ将Chy3基因组切为2个条带，与线性电子酶切图谱相同，所以Chy3基因组很可能是线性。5分枝杆菌噬菌体基因预测及基因组注释5.1Chy1⑴Chy1基因组全长为47198bp，G＋C含量为63.68%，基因平均长度为562bp，基因密度为0.92。Chy1有显著的遗传子偏嗜性，未发现串联重复序列，共预测出5个tRNA。⑵采取gpmmer软件浅析，确定了77个推定基因(GL)，对这些基因进行同源检索浅析，得到29个已知功能的基因。GL05、GL10、GL12、GL13、GL20、GL23、GL24和GL25为噬菌体的结构基因；GL06、GL07和GL08分别编码LysA、hopn和LysB；GL31为整合酶基因，GL70推定为阻遏蛋白类似基因，与D29p72基因序列100％相似，D29p72在进化历程中丢失了N-末端的一个片段，缺乏完整的HTH模体，不能结合到宿主菌DNA上，因而不能形成溶原性反应，即Chy1为裂解性噬菌体。GeneMark软件浅析，共预测出71个推定基因(GM)，其中有55个基因与gpmmer软件浅析结果相同，有16个不同的基因，通过比对，发现GM22与GL23， GM08与GL09， GM51与GL55， GM52与GL56具有相同功能，其余基因未能匹配上已知功能的基因。5.2Chy2⑴Chy2基因组全长为40017bp， G+C=66.73%，基因平均长度为656bp，基因密度为0.951。Chy2有显著的遗传子偏嗜性，共发现3个串联重复序列，未发现tRNA。⑵采取gpmmer在线浅析软件浅析，确定了58个推定基因，对这些基因进行同源检索浅析，得到16个已知功能的基因。GL02、GL05、GL06、GL12、GL13、GL15、GL17和GL19为噬菌体的结构基因；GL26、GL27分别编码LysA和LysB，未发现hopn基因；GL31为整合酶基因，GL32推定为阻遏蛋白基因，与分枝杆菌噬菌体Halo的gp33基因序列100％相似，Halo是溶原性噬菌体，gp33表达的产物是阻遏蛋白，即Chy2为溶原性噬菌体。GeneMark软件浅析，共预测出54个推定基因，其中有44个基因与gpmmer软件浅析结果相同，有10个不同的基因，通过比对，发现GM15与GL12具有相同功能，其余基因未能匹配上已知功能的基因。5.3Chy3⑴Chy3基因组全长为40070bp， G+C=66.86%，基因平均长度为667bp，基因密度为0.97。Chy3有显著的遗传子偏嗜性，共发现3个串联重复序列，未发现tRNA。⑵采取gpmmer在线浅析软件浅析，确定了58个推定基因，对这些基因进行逐个同源检索浅析，得到20个已知功能的基因。GL01、GL41、GL43、GL45、GL47、GL48、GL54、GL55和GL58为噬菌体的结构基因，位于整合酶基因(GL29)的两侧；GL33、GL34分别编码LysB和LysA，未发现hopn基因和编码阻遏蛋白的基因，即Chy3为裂解性噬菌体。GeneMark软件浅析，共预测出56个推定基因，其中有46个基因与gpmmer软件浅析结果相同，有10个不同的基因，通过比对，发现GM43与GL43具有相同功能，其余基因未能匹配上已知功能的基因。5.4Chy4⑴Chy4基因组全长为46639bp， G+C=63.68%，基因平均长度为586bp，基因密度为0.92。Chy4有显著的遗传子偏嗜性，未发现串联重复序列，共发现5个tRNA。⑵采取gpmmer在线浅析软件浅析，确定了73个推定基因，对这些基因进行同源检索浅析，得到28个已知功能的基因。GL05、GL10、GL12、GL13、GL20、GL23、GL24和GL25为噬菌体的结构基因；GL06、GL07和GL08分别编码LysA、hopn和LysB；GL31为整合酶基因，GL71与编码噬菌体L5阻遏蛋白的gp71相似性为86.3％，L5gp71具有183aa，而Chy4GL71仅含155个aa，是否能编码有活性的阻遏蛋白还未知，即Chy4很可能为溶原性噬菌体。GeneMark软件浅析，共预测出70个推定基因，其中有55个基因与gpmmer软件浅析结果相同，有15个不同的基因，通过比对，发现GM09与GL09，GM23与GL23，GM46与GL47，GM54与GL57具有相同功能，其余基因未能匹配上已知功能的基因。5.5Chy5⑴Chy5基因组全长为51214bp，G+C=66.74%，基因平均长度为530bp，基因密度为0.91。Chy5有显著的遗传子偏嗜性，未发现串联重复序列，共发现5个tRNA。⑵采取gpmmer在线浅析软件浅析，确定了88个推定基因，对这些基因进行逐个同源检索浅析，得到29个已知功能的基因。GL05、GL10、GL12、GL13、GL20、GL23、GL24和G论文导读：
L25为噬菌体的结构基因；GL06、GL07、GL08分别编码LysA、hopn和LysB；GL31为整合酶基因，gene70与分枝杆菌噬菌体Pukovnik编码阻遏蛋白的基因gp72相似性为70.81％，推定为编码阻遏蛋白的基因，是否能编码有活性的阻遏蛋白还未知，即Chy5很可能为溶原性噬菌体。GeneMark软件浅析，共预测出86个基因，其中有68个基因与Gpmmer3.0软件浅析结果相同，有18个不同的基因，通过比对，发现GM09与GL09，GM12与GL12，GM23与GL23，GM55与GL54，GM63与GL62具有相同功能，其余基因未能匹配上已知功能的基因。6分枝杆菌噬菌体比较基因组学6.1共线性浅析⑴Chy1同源性最高的两株噬菌体为D29和Che12，可归入ClusterA，同源性基因分布在整个基因组，具有清晰的共线性。Chy1基因组77个基因中有75个基因与D29的基因具有同源性，有60个基因与Che12的基因具有同源性。⑵Chy2同源性最高的两株噬菌体为BPs和Angel，可归入ClusterG，同源性基因分布在整个基因组，具有清晰的共线性。Chy2基因组58个基因中有57个基因均与这两个噬菌体具有同源性。⑶Chy3同源性最高的两株噬菌体为BPs和Angel，可归入ClusterG，同源性基因分布在整个基因组，Chy3基因组58个基因组中有56个基因均与这两个噬菌体具有同源性。Chy3基因组前3个基因与BPs和Angel前3个基因匹配，但以第4个基因开始与BPs和Angel的同源基因排列顺序相反。⑷Chy4同源性最高的两株噬菌体为D29和Che12，可归入ClusterA，同源性基因分布在整个基因组，具有清晰的共线性。Chy4基因组73个基因组中有70个基因与D29具有同源性，有54个基因与Che12具有同源性。⑸Chy5同源性最高的两株噬菌体为D29和Pukovnik，可归入Cluster A，同源性基因分布在整个基因组，具有清晰的共线性。Chy5基因组88个基因组中有70个基因与D29具有同源性，有57个基因与Pukovnik具有同源性。6.2进化树浅析对14株分枝杆菌噬菌体基因组进行系统发育浅析构建进化树，距离越近，噬菌体间亲缘联系越近。Chy1与D29亲缘联系最近，Chy4与Chy5亲缘联系最近， Chy2与BPs、Angel亲缘联系最近，Chy3与Legendre亲缘联系最近。结论5株分枝杆菌噬菌体均属于双链DNA病毒群(群Ⅰ)，尾病毒目，长尾病毒科。Chy1和Chy3为裂解性噬菌体，Chy2为溶原性噬菌体，Chy4和Chy5为可疑溶原性噬菌体，基因组学探讨未在噬菌体基因组中发现毒力基因。5株噬菌体均能裂解耐药结核分枝杆菌，Chy3潜伏期短，体外裂菌能力强且能裂解巨噬细胞内结核分枝杆菌，最具有抗结核潜力。本探讨初步探明5株新分枝杆菌噬菌体抗结核菌的潜力和遗传背景，为下一步开发利用噬菌体提供论述基础和策略指导。关键词：分枝杆菌噬菌体论文结核分枝杆菌论文分离论文生物学特性论文基因组学论文
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英汉缩略语名词对照6-8
摘要8-19
ABSTRACT19-29
前言29-30
第一部分 分枝杆菌噬菌体分离和生物学特性探讨30-58
第一章 分枝杆菌噬菌体的分离30-34
1 试剂与材料30-32
2 策略32-33
3 实验结果33-34
第二章 分枝杆菌噬菌体实验策略优化34-38
1 试剂与材料34-35
2 实验策略35-36
3 结果36-38
第三章 分枝杆菌噬菌体部分生物学特性探讨38-44
1 试剂与材料38-39
2 策略39-40
3 实验结果40-44
第四章 分枝杆菌噬菌体体外杀菌实验44-54
1 试剂与材料44-45
2 策略45-49
3 结果49-54
讨论54-58
第二部分 分枝杆菌噬菌体基因组学探讨58-92
第一章 分枝杆菌噬菌体全基因组序列测定58-67
1 试剂与材料59
2 策略59-62
3 结果62-67
第二章 分枝杆菌噬菌体基因预测及功能注释67-83
1 材料与软件67
2 策略67
3 结果67-83
第三章 分枝杆菌噬菌体比较基因组学浅析83-86
1 材料与软件83
2 策略83
3 结果83-86
讨论86-92
全文总结92-95
参考文献95-101
附表101-125
文献综述125-135
参考文献132-135
致谢135-136
攻读博士学位期间探讨成果136-137