简述连接三七单体皂苷对细胞缝隙连接影响与其增强顺铂细胞毒性作用联系

论文导读：
摘要：目的：观察三七单体皂苷（Rg1、Rb1、R1、Re）对稳定表达连接蛋白32和连接蛋白26（connexin32/connexin26, Cx32/26）的Hela细胞缝隙连接(gap junction, GJ)功能的作用及其对顺铂细胞毒性的影响；同时进一步探讨三七单体皂苷能否通过转变GJ功能增强顺铂的细胞毒性作用。策略：1.转染并稳定表达Cx32/26的Hela细胞的培养、筛选及诱导：本实验选用利用双向质粒（能够表达异质性Cx32/26(PBI-Cx32T/Cx26)的载体质粒）转染的HeLa细胞。这种双向质粒可以在一个启动子的制约下同时表达Cx32和Cx26。一般情况下，Cx不表达；需要表达时，先用含G-418、潮霉素的培养基筛选细胞，然后在培养基中加入多西环素（Doxycycpne，Dx）诱导Cx表达。这样能够避开因过度表达Cx引起的细胞伤害。2.“细胞接种荧光示踪法”观察三七单体皂苷对培养细胞GJ功能的影响：将表达有Cx32/26的HeLa细胞与荧光剂Calcine-AM共同孵育，制成“供体细胞（“Donor cell”）,在“Donor cell”中加入不同浓度的药物。显微镜下挑选生长融合的细胞作为接受细胞，将上面陈述的含有不同药物的“Donor cell”接种到接受细胞上，培养4小时,待形成稳定的GJ后,荧光显微镜下观察，计数一个“供体细胞”周围含有Calcine的“接受细胞”数作为评价GJ功能的指标。3.“标准细胞集落形成浅析法”观察三七皂苷对顺铂细胞毒性的影响：用不同密度接种细胞的策略分别获得有GJ形成（已融合）的细胞和无GJ形成（未融合）的细胞。在上面陈述的细胞，观察三七皂苷单体预处理4h后，顺铂作用1h，对培养细胞的集落数的影响是否是通过GJ产生的。以细胞集落形成率的降低作为顺铂的细胞毒性指标。4.蛋白免疫印迹技术（Western blot）检测三七单体皂苷对细胞中Cx32/26的表达水平的影响：收集细胞，提取细胞总蛋白；BCA法蛋白定量，100°C煮沸5min，使蛋白质变性；15%聚丙烯酰氨凝胶电泳；电转移至PVDF膜上；Western封闭液封闭2h；一抗孵育过夜；洗膜后二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG（1:5000）孵育1h；洗膜后于BIO-RAD凝胶成像系统，Quantity One浅析软件对实验结果进行浅析。结果：1.“标准细胞集落形论文导读：毒性，而在无GJ形成的细胞，Rg1对顺铂的细胞集落形成率无显著影响；在有GJ形成的细胞和无GJ形成的细胞，R1（50μM）与顺铂合用组的细胞集落形成率与顺铂组相比较均无显著差别（P0.05），结果表明R1对顺铂的细胞毒性无显著影响。结论：1.有GJ形成时，下调细胞GJ功能能显著降低顺铂的细胞毒性；上调细胞GJ功能能显著增强顺铂的细胞毒性。2
成浅析法”结果显示在有GJ形成的细胞，GJ抑制剂2-APB（2.3μg/ml）可显著升高顺铂组的细胞集落形成率（P0.05）；GJ增强剂RA（3μg/ml）可显著降低顺铂组的细胞集落形成率（P0.05）。结果表明增强GJ功能可增强顺铂的细胞毒性，降低GJ功能可减弱顺铂的细胞毒性。2.“细胞接种荧光示踪法”结果显示，与阴性对照组相比较，Rb1(5μM-100μM)和Re(5μM-100μM)作用4h对细胞GJ功能均无显著影响（P0.05）；5μM、10μM Rg1对GJ功能的影响与阴性对照组比较无显著统计学差别（P0.05），25μM、50μM、100μM Rg1作用细胞4h后，供体细胞周围含有Calcine-AM的接受细胞数目显著增加，且呈一定的剂量依赖性，其中100μM Rg1对GJ功能的增强作用最为显著，其增强率为44.04%±8.71%；100μM Rg1作用不同时间（4h、24h、48h）对GJ功能的影响无显著差别（P0.05）；R1（10μM-100μM）能浓度依赖性的增强由Cx32/26组成的HeLa细胞的GJ功能，50μM R1继续作用24h、48h对GJ功能的影响与4h相比较无显著差别。3.Western blot结果显示，与阴性对照组比较，不同浓度的Rg1（25μM-100μM）和R1（25μM-100μM）作用4h对HeLa细胞Cx32/26的表达水平均无显著性差别（P0.05）。4.在有GJ形成的细胞，100μM Rg1预处理细胞4h后，加入顺铂作用1h，Rg1与顺铂联合利用组的细胞集落形成率(0.29±0.12)显著低于单用顺铂组(0.48±0.07)，表明在有GJ形成时Rg1能增强顺铂的细胞毒性，而在无GJ形成的细胞，Rg1对顺铂的细胞集落形成率无显著影响；在有GJ形成的细胞和无GJ形成的细胞，R1（50μM）与顺铂合用组的细胞集落形成率与顺铂组相比较均无显著差别（P0.05），结果表明R1对顺铂的细胞毒性无显著影响。结论：1.有GJ形成时，下调细胞GJ功能能显著降低顺铂的细胞毒性；上调细胞GJ功能能显著增强顺铂的细胞毒性。2.Rb1、Re对Cx32/26组成的GJ功能无显著影响，Rg1、R1能显著增强Cx32/26组成的GJ功能。3.Rg1、R1对GJ功能的增强作用与Cx32/26的表达无关。4. Rg1能通过增强细胞GJ功能增强顺铂的细论文导读：
胞毒性。关键词：Rg1论文Rb1论文R1论文Re论文缝隙连接论文连接蛋白论文顺铂论文
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Abstract6-8
前言8-13
材料与策略13-17
结果17-26
讨论26-29
结论29-30
参考文献30-33
致谢33-34
附录34-43
附录A、英文词汇对照表34-35
附录B、主要试剂的配制35-37
附录C、探讨生学习期间已发表文章37-38
附录D、综述38-43
参考文献41-43