雄性生殖系统抗菌肽体内功能探讨及其相关策略学建立

论文片段—mBin1b论文,mBD-12论文,mBD-37论文,条件性诱导论文,RNA干扰论文,
摘要：雄性生殖系统有具有抗菌活性的蛋白,β-防御素就是其中的一类,它们是由上皮细胞分泌表达的,是先天免疫系统的成员,而作为雄性生殖系统的抗菌肽,它们也可能与生育的关系。本论文对小鼠附睾专一表达的mBin1b基因展开了较为系统的研究,包括体外的抗菌活性研究和在过表达转基因小鼠体内的功能的研究原创论文。同时对另外两个在附睾中表达的抗菌肽基因mBD-12和mBD-37也了体外抗菌活性的初步研究毕业论文选题。在研究中同时建立了研究雄性生殖系统抗菌肽的方法学,包括抗菌肽的表达,细菌炎症模型的建立,及四环素调控的条件性RNAi毕业总结范文。研究发现mBin1b、mBD-12和mBD-37在体外都具有抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的作用,且抗革兰氏阴性菌大肠杆菌比抗革兰氏阳性菌葡萄球菌的能力要强,它们的抗菌活性是盐离子浓度敏感的。研究中了与内源基因表达模式基本一致的mBin1b过表达转基因小鼠,它们的表型基本正常,且能健康生存和生育,在细菌性附睾炎实验时与野生型相比,表现出很强的抵抗大肠杆菌的能力,且在感染时保持了更高的精子活力;本论文揭示了mBin1b作为潜在药物的安全性和可能性。本论文还发展了一个非常的四环素调控的条件性RNAi系统,有助于开展抗菌肽功能的研究,并对在细胞中表达活性抗菌肽了有益的建议。关键词：mBin1b论文mBD-12论文mBD-37论文条件性诱导论文RNA干扰论文
摘要6-7
ABSTRACT7-9
章 抗菌肽的性质与功能研究进展9-24
前言9

1. 抗菌肽与免疫防线9-11

2. 抗菌肽基因及其家族11-13

3. 抗菌肽表达异常与疾病13

4. 抗菌肽的理化特性与分类13-14

5. 抗菌肽的抗微生物活性14-15

6. 抗菌肽对癌细胞的杀伤作用15

7. 抗菌肽与精子成熟15

8. 抗菌肽的信号分子作用15-16
9. 抗菌肽的表达和调控16-17
10. 抗菌肽基因的的发现与表达纯化17-18
前景与展望18-19
参考文献19-24
章BIN18抗菌活性及其在抗细菌性附睾炎中的作用研究24-61
引言24-25
与方法25-33

1. 质粒和菌株25

2. 工具酶25

3. 主要生化试剂25

4. 质粒的构建25-27

1) 用于在C057 细胞中表达Bi1116的表达载体构建25-26
2) 用于mBi1116转基因小鼠载体pmE-mBi1116HA的构26
3) pcH54/mE-mBi1116HA载体的构建26
4) pBS-U6/mBi1116载体的构建26-27
5) pMD18-T/actin质粒的构建27

5. DNA的制备27

6. COS7细胞的转染27

7. 显微注射与受精卵移植27-28

8. 小鼠尾巴基因组DNA的抽提28
9. 转基因小鼠的PCR鉴定28
10. RNA 抽提28
1

1. CDNA的反转录28-29

1

2. RT-PCR反应29

1

3. REAL-TIME RT-PCR29

1

4. 蛋白的抽提29

1

5. 蛋白质浓度的测定29-30

1

6. 蛋白电泳30

1

7. 蛋白印迹（WESTERN BLOT）30-31

18. 组织切片及免疫组化分析31-32
19. 抗菌分析实验32
20. 小鼠生育能力实验32
2

1. 精子浓度及运动情况检测实验（CASA）32-33

2

2. 小鼠输精管大肠杆菌逆流注射致附睾炎实验33

2

3. 数据的统计分析33

实验结果33-55

1. MBIN1B体外抗菌活性研究33-38

1) 用于COS7 细胞表达的mBin1b 表达载体的构建33-34
2) mBin1b RNA干扰载体pBS-U6/mBin1b的构34-35
3) mBin1b的COS7 细胞瞬时转染和对大肠杆菌的抗性分析35-36
4) mBin1b 对白色葡萄球菌的抗性分析36-37
5) mBin1b抗菌活性的盐离子浓度敏感性37-38

2. MBIN1B过表达转基因小鼠的研究38-55

1) mBin1b过表达转基因小鼠载体的构建38-40
2) 转基因小鼠的的PCR鉴定和传代建系40-41
3) 转基因小鼠的RNA表达的检测41-44
4) 转基因小鼠蛋白表达的检测44-46
5) 免疫组化46-47
6) 转基因小鼠的生育能力实验47-48
7) 小鼠附睾炎模型的建立48-49
8) 转基因小鼠附睾与野生型小鼠附睾抗大肠杆菌能力的比较49-55
ⅰ抗菌实验49-50
ⅱ小鼠附睾外观比较50-51
ⅲ附睾病理组织切片51-52
ⅳ精子运动及浓度的测定52-54
ⅴ不同浓度梯度大肠杆菌的体内抗菌实验54-55
讨论55-57
参考文献57-61
章 MBD-1

2、MBD-37 抗菌肽体外抗菌活性的研究61-77

引言61-62
与方法62-67

1. 质粒和菌株62

2. 工具酶62

3. 主要生化试剂62

4. COS7细胞PCDNA3 表达载体的构建62

5. 毕赤酵母PPIC-9 表达载体的构建62-63

6. 细胞转染用DNA的制备63

7. COS7 细胞的转染63-64

8. 酵母表达用培养基的配制64
9. 毕赤酵母GS115 电转化感受态细胞的制备和转化64-65
10. 酵母转化子的PCR鉴定65
1

1. 抗菌肽在酵母中的诱导表达65-66

1

2. 组织RNA的抽提66

1

3. CDNA的反转录66

1

4. RT-PCR反应66

1

5. 抗菌分析实验66-67

1

6. 数据的统计分析67

实验结果67-73
1. MBD-1

2、MBD-37 在小鼠中的表达67

2. PCDNA3-MBD1

2、PCDNA3-MBD37 表达载体的构建67-68

3. 毕赤酵母PPIC9 表达载体的构建68-69

4. MBD-12/37 COS7 细胞转染上清的抗菌活性实验69-70

5. MBD-12/37 毕赤酵母表达上清的抗菌活性分析70-72

1) 抗大肠杆菌活性分析70-71
2) 抗金葡萄球菌活性分析71-72
6. mBD-12, mBD-37 抗菌活性的盐离子浓度敏感性实验7论文片段—5.抑菌实验846.数据的统计分析84实验结果84-911.RTETOCT转录激活型条件性RNAI系统的建立84-862.四环素诱导的条件性RNAI对细胞中内源性基因和外源性基因的抑制86-893.SHRNAS在非诱导下的漏表达894.条件性RNAI系统的诱导药物剂量依赖性和诱导时间依赖性89-91讨论91-93参考文献93-9696-97致谢97-99发表文章及参编书目99-mBin1b论文,mBD-12论文,mBD-37论文,条件性诱导论文,RNA干扰论文,
2-73
讨论73-74
参考文献74-77
章 四环素诱导的激活型条件性RNA干扰系统的建立77-96
引言77-78
与方法78-84

1. 载体的构建78-83

1) 小鼠U6 启动子载体的构建78-79
2) TRE-U6 重组载体的构建79
3) 重组转录激活蛋白载体的构建79-80
4) shRNAs序列的克隆80-82
5) mBin1bHA表达载体的构建82-83

2. 细胞的培养和转染83

3. 蛋白质印迹（WESTERN BLOT）83

4. REAL-TIME RT-PCR83-84

5. 抑菌实验84

6. 数据的统计分析84

实验结果84-91

1. RTETOCT转录激活型条件性RNAI系统的建立84-86

2. 四环素诱导的条件性RNAI对细胞中内源性基因和外源性基因的抑制86-89

3. SHRNAS在非诱导下的漏表达89

4. 条件性RNAI系统的诱导药物剂量依赖性和诱导时间依赖性89-91

讨论91-93
参考文献93-96
96-97
致谢97-99
发表文章及参编书目99-100