简论胁迫微生物胁迫下东北林蛙皮肤抗菌肽和功能蛋白差别表达技巧

论文导读：北林蛙论文微生物胁迫论文抗菌肽论文功能蛋白论文本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要4-6Abstract6-171绪论17-311.1引言171.2两栖类抗菌肽的探讨进展17-221.

2.1两栖类抗菌肽的分类及体内分布17-181.2两栖类抗菌肽的结构特点18-

摘要：两栖类动物的皮肤在长期进化历程中形成了以抗微生物活性肽为主要成分的比较改善的机体先天免疫防御系统,用以应对环境中多种微生物的侵袭。然而,近年来两栖类种群数量却呈全球性急剧下降,其主要理由之一是由于环境中病原微生物导致的感染性疾病的暴发。虽然近年来对两栖类皮肤活性肽进行了大量的探讨,但两栖类如何通过皮肤固有免疫防御机制和存活对策应对环境致病性微生物所带来的威胁,以及两栖类皮肤的先天免疫应答与环境致病性微生物之间的联系目前尚不清楚。由此,利用分子生物学、质谱、高效液相色谱和差别蛋白质表达等技术策略探讨病原微生物对两栖类先天免疫防御系统中皮肤活性肽分泌表达变化和规律,对于揭示两栖类在抵御病原微生物侵袭时机体所采取的固有免疫应答机制和对策提供科学依据,对处于濒危状态的两栖类物种的保护具有重要的论述作用和运用价值。本探讨以东北地区两栖类的代表物种东北林蛙(Rana dybowskii)为探讨对象,选择不同致病性微生物(E.cop、S.aureus、R和A.hydrophila)作为环境胁迫因子,采取RP-HPLC、2D电泳、ESI-MS/MS、荧光定量PCR和高通量表达谱技术等,探讨致病性微生物胁迫后蛙皮肤及分泌物中抗菌肽和功能蛋白表达的变化,获得新发现的蛙皮肤抗菌肽基因cDNA序列,并测定了皮肤中抗菌肽和Toll样受体(TLRs)的cDNA不同时间点的表达量变化,及转录组水平的基因表达谱的变化。本探讨获得的主要结果如下：1.特定细菌胁迫下东北林蛙皮肤功能蛋白的差别表达2D电泳和Nano-UPLC-ESI-MS/MS质谱结果显示E.cop、S.aureus胁迫后在分泌物鉴定出7种有差别的功能蛋白,分别为：超氧化物歧化酶A (Superoxide Diutase A, SOD A)、激素原转化酶1(prohormone convertase1, PC1)、磷蛋白-1A(Phosphoprotein1A)、碳酰还原酶1(carbonyl reductase1, CBRl)、膜联蛋白A1(annexin A1, ANX-A1)、cofipn-1B (CFL-1B)和组蛋白4(histones, H4)。揭示上面陈述的功能蛋白可能参与东北林蛙的自身免疫历程或在免疫历程中起到调节作用。2.蛙类易感细菌胁迫下东北林蛙皮肤抗菌肽的差别表达E.cop、S.aureus、R胁迫下,RP-HPLC、ESI-MS/MS和N端测序结果显示,以东北林蛙皮肤分泌物中获得8个家族的14种多肽序列,四条为全长序列,其它为可信度较高的非全长肽段；其中抗菌肽13条,分属Brevinina-1家族、Brevinina-2家族、Ranatuerin-2家族、Japonicin-1家族、Dybowskin-1家族、Palustrin-2家族、Temperin-1家族和Bradykinin家族。表明东北林蛙皮肤抗菌肽的分泌表达呈多样性,其E.cop、 S.aureus、R胁迫下的抗菌肽谱显示抗菌肽能够为机体提供针对微生物侵袭的动态防御。3.蛙类易感病毒胁迫下东北林蛙皮肤抗菌肽及其TLRs的差别表达虹彩病毒R胁迫后RT-PCR技术获得了5条新的东北林蛙皮肤抗菌肽cDNA序列：Dybowskin-YJa、Dybowskin-YJb、Temperin-YJa、Temperin-YJb、Ranatuerin-2YJ。定量PCR检测抗菌肽Ranatuerin-2YJ(JN126048)和Temporin-1(EU624139)以及TLRs基因在R胁迫后的动态表达,结果发现在先天免疫阶段TLR和抗菌肽基因均呈上调表达,且TLR上调时间先于抗菌肽,其中有6类TLR参与了抗R感染的免疫应答,提示TLR作为启动先天免疫应答的方式识别受体可能参与抗菌肽的表达调控历程。TLR1和TLR8在1h内迅速出现表达高峰,表明TLR1和TLR8可能参与机体特异识别R的历程,在连接固有免疫和获得免疫的关键环节可能发挥重要作用。R胁迫下其皮肤分泌物具有较强R和S.aureus活性,溶血活性低。4.蛙类易感细菌胁迫下东北林蛙皮肤转录组免疫相关基因的差别表达嗜水气单胞菌A.hydrophila胁迫6h后,高通量表达谱测序技术以蛙皮肤获得了1435条表达量变化显著的基因,其中免疫相关基因有106条,包括：brevinin-1、 TLR5、C-type lectin、roe lectin lysozyme、alpha-macroglobupn、Ig、MHC I和MHC II等免疫相关基因,作为先天免疫和获得性免疫的重要组成。结果显示A.hydrophila胁迫后,机体可能通过上面陈述的免疫相关基因的协同作用发挥皮肤免疫防御机制,抵御环境致病性微生物侵袭。此外,尚未被注释的差别基因可能在机体免疫应答中发挥调控作用。探讨结果表明,不同微生物胁迫后,东北林蛙皮肤抗菌肽和免疫相关基因得以表达,皮肤分泌多种抗菌肽、产生免疫功能蛋白,协同作用抵御环境致病性微生物。该探讨结果为进一步理解两栖类动物免疫系统的组成和机制提供了思路。关键词：东北林蛙论文微生物胁迫论文抗菌肽论文功能蛋白论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要4-6
Abstract6-17
1 绪论17-31

1.1 引言17

1.2 两栖类抗菌肽的探讨进展17-22

1.2.1 两栖类抗菌肽的分类及体内分布17-18

1.2.2 两栖类抗菌肽的结构特点18-20

1.2.3 两栖类抗菌肽的理化特性20-21

1.2.4 微生物诱导下的抗菌肽的变化21-22

1.3 两栖类Toll样受体的探讨进展22-25

1.3.1 TLRs的免疫学功能22-23

1.3.2 TLRs信号传递途径23-24

1.3.3 TLRs在宿主免疫防御中的地位24-25

1论文导读：离分泌物并收集洗脱峰41-423.3.6洗脱峰的抑菌活性检测423.3.7具有抑菌活性的洗脱峰的二次分离423.3.8抗菌肽的序列测定423.4结果42-533.4.1正常状态东北林蛙皮肤分泌物RP-HPLC图谱42-433.4.2微生物胁迫后6～72h东北林蛙皮肤分泌物的差别浅析43-463.4.3东北林蛙皮肤分泌物洗脱峰的抑菌活性检测及N端测序46-483.4.4东北
.4 两栖类皮肤功能蛋白的探讨25-28

1.5 病原微生物与宿主相互作用的探讨进展28-29

1.6 本探讨的目的和作用29-30

1.7 本项探讨采取的技术路线30-31

2 特定细菌胁迫下东北林蛙皮肤功能蛋白的差别表达31-39

2.1 引言31-32

2.2 材料和策略32-34

2.1 东北林蛙和方式菌株32

2.2 构建东北林蛙细菌感染模型32

2.3 东北林蛙皮肤分泌物的收集32

2.4 二维凝胶电泳浅析32-33

2.5 图像浅析33

2.6 质谱浅析33-34

2.3 结果34-37

2.3.1 2-DE浅析差别表达的蛋白34-35

2.3.2 NanoUPLC-ESI-MS/MS鉴定差别表达的蛋白35-37

2.4 小结37-39

3 蛙类易感细菌胁迫东北林蛙皮肤抗菌肽的差别表达39-55

3.1 引言39

3.2 材料39-41

3.

2.1 实验动物及微生物39

3.

2.2 主要仪器39-40

3.

2.3 主要试剂40

3.

2.4 试剂配制40-41

3.3 策略41-42

3.1 实验分组41

3.2 实验动物的处理——虹彩病毒刺激东北林蛙41

3.3 东北林蛙皮肤分泌物的收集及蛋白浓度测定41

3.4 RP-HPLC上样前皮肤分泌物的预处理41

3.5 C18柱分离分泌物并收集洗脱峰41-42

3.6 洗脱峰的抑菌活性检测42

3.7 具有抑菌活性的洗脱峰的二次分离42

3.8 抗菌肽的序列测定42

3.4 结果42-53

3.4.1 正常状态东北林蛙皮肤分泌物RP-HPLC图谱42-43

3.4.2 微生物胁迫后6～72h东北林蛙皮肤分泌物的差别浅析43-46

3.4.3 东北林蛙皮肤分泌物洗脱峰的抑菌活性检测及N端测序46-48

3.4.4 东北林蛙皮肤分泌物多肽组分的质谱浅析48-52

3.4.5 测序所得四条多肽的理化性质和结构预测52-53

3.5 小结53-55

4 蛙类易感病毒(虹彩病毒)胁迫下东北林蛙皮肤抗菌肽及其TLRs的差别表达55-81

4.1 引言55

4.2 材料55-58

4.

2.1 试验动物及毒株55-56

4.

2.2 主要仪器56

4.

2.3 主要试剂56

4.

2.4 试剂的配制56-58

4.3 策略58-69
4.

3.1 引物设计58

4.

3.2 毒液制备58

4.

3.3 虹彩病毒接种58

4.

3.4 皮肤分泌物与皮肤组织采集58-59

4.

3.5 皮肤分泌物粗提物的制备59

4.

3.6 R感染检测59

4.

3.7 组织总RNA提取、纯化及完整性检测59-60

4.

3.8 反转录及荧光定量PCR60-62

4.

3.9 定量PCR的数据处理62

4.

3.10 R感染检测62-63

4.

3.11 东北林蛙活性肽的基因克隆63-65

4.

3.12 东北林蛙特定活性肽基因的表达变化65-66

4.

3.13 胁迫前后皮肤分泌物蛋白多肽浓度测定66

4.

3.14 皮肤分泌物及合成肽抗微生物活性试验66-68

4.

3.15 皮肤分泌物的溶血活性试验68

4.

3.16 抗虹彩病毒活性试验68-69

4.4 虹彩病毒感染69-70

4.1 解剖观察结果69

4.2 病毒DNA检测69-70

4.5 总RNA质量70

4.6 TLRs mRNA的动态表达70-73

4.7 东北林蛙活性肽基因克隆结果73-75

4.7.1 RT-PCR扩增结果73-74

4.7.2 重组质粒的PCR检测结果74

4.7.3 活性肽cDNA序列及其编码的活性肽74-75

4.8 Real-time PCR检测目的基因的表达变化75-76

4.9 皮肤分泌物及合成肽抗微生物活性测定76-79

4.9.1 细胞毒性测定76-77

4.9.2 抗病毒活性测定77-78

4.9.3 抑菌活性测定78-79

4.10 皮肤分泌物溶血活性测定79

4.11 小结79-81

5 蛙类易感细菌(嗜水气单胞菌)胁迫下东北林蛙皮肤转录组免疫相关基因的差别表达81-92

5.1 引言81

5.2 实验材料81-82

5.

2.1 实验动物81-82

5.

2.2 主要试剂82

5.

2.3 主要仪器82

5.3 实验策略82-84
5.

3.1 菌液的制备82

5.

3.2 实验动物预处理与样品采集82

5.

3.3 总RNA提取与质量检测82-83

5.

3.4 表达谱文库构建、测序及功能注释83

5.

3.5 测序评估83

5.

3.6 表达差别基因的筛选与功能浅析83-84

5.4 结果与浅析84-90
5.

4.1 测序评估84-85

5.

4.2 差别表达基因筛选85-86

5.

4.3 差别表达基因的聚类浅析86-87

5.

4.4 差别表达基因在细胞信号通路上的变化87-88

5.

4.5 差别表达的免疫相关基因的探讨88-90

5.5 小结90-92
结论92-93
参考文献93-110
攻读学位期间发表的学术论文110-112
致谢112-113