简论免疫调节鱼类卵黄高磷蛋白衍生抗菌肽免疫调节功能学年

论文导读：表明，外源菌感染的情况下，Pt5注射组在注射后6h和12h能显著降低四种促炎症因子基因il-1β,il-6,tnf-α和ifn-γ的表达量，而M13注射组和PBS注射组在感染病原菌后，促炎症细胞因子mRNA则大量表达。在对抗炎症因子的表达影响中，Pt5注射12h后，Pt5能显著提升抗炎症因子基因il-10和il-4的表达量。综合以上实验结果，我们认为大剂量的
摘要：在鱼类对外界刺激及病原物侵袭的防御反应中，非特异性免疫起着重要作用。抗菌肽(AMPs)作为效应分子在宿主防御抵御病原体中扮演一个重要的天然免疫中的作用,当机体遇到病原体入侵时,以活体形式由相应的细胞合成并释放出来,发挥抗菌作用及其它生物学功能，在鱼体与病原生物不断抗争的历程中起到固有防御的作用。抗菌肽除去具有抗菌功能，还普遍具有免疫调节功能。本论文是以前发现的卵黄高磷蛋白Pv具有免疫防御作用的探讨基础上，特别是发现Pv截断形成的小分子也具有抗菌活性的基础上，开展Pv免疫调节作用的探讨。目前，已经有大量关于抗菌肽在鱼类的免疫防御中发挥功能的探讨报道，但在免疫调节方面的作用及其机理的探讨极其少见。我们以以下几个方面探讨了Pv衍生的抗菌活性肽Pt5在鱼类对抗病原菌感染中的免疫功能及其机理：一、建立斑马鱼败血症模型通过腹腔注射重组表达的抗菌肽Pt5是否具有免疫保护和调节功能，二、通过分子生物学手段探讨抗菌肽在斑马鱼受到病原菌侵害时，对斑马鱼体内免疫调节和保护作用的机理。首先，在原核重组表达抗菌肽Pt5的历程中，利用近年来Studier等人提出的先进的外源基因自诱导表达对策无论在产出蛋白的质量还是数量上都比传统策略都有很大提升，克服了具有细胞毒性抗菌肽表达量小，多在包涵体中表达的不足，充分保留了融合蛋白的活性，为后续的内体实验奠定了基础。其次，通过建立嗜水气单胞菌A.hydrophila引起的斑马鱼败血症模型，探讨了具有抗菌活性的蛋白小肽Pt5在急性细菌性鱼类败血症中的生物学功能。结果显示急性细菌感染后，Pt5注射组斑马鱼的存活率较对照组和无活性的Pt5突变体M13注射组都显著提升，并且显著降低了组织器官的染菌数量，通过对斑马鱼外周血细胞的检测，发现Pt5注射组能调节病原菌感染斑马鱼免疫细胞的变化，缓解宿主体内强烈的炎症反应，减轻斑马鱼病原菌感染的症状，对斑马鱼在急性病原菌感染中起到了保护性作用。为明确Pt5在斑马鱼急性感染中的作用机制，通过荧光实时定量技术，注射抗菌蛋白Pt5后，检测斑马鱼体内免疫相关的促炎细胞因子和抗炎症细胞因子在两个重要免疫器官脾、头肾组织中的表达变化。结果表明，外源菌感染的情况下，Pt5注射组在注射后6h和12h能显著降低四种促炎症因子基因il-1β, il-6, tnf-α和ifn-γ的表达量，而M13注射组和PBS注射组在感染病原菌后，促炎症细胞因子mRNA则大量表达。在对抗炎症因子的表达影响中，Pt5注射12h后，Pt5能显著提升抗炎症因子基因il-10和il-4的表达量。综合以上实验结果，我们认为大剂量的抗菌肽Pt5在斑马鱼细菌性感染历程中所起到的免疫调节和保护作用，可能是直接地杀死病原菌，而不是通过激活鱼体内炎症反应来抵抗病原菌的急性感染，在体内炎症反应加剧的时候，能够发挥免疫调节机制，降低促炎症反应的效应因子，并诱导抗炎症反应的效应因子的产生，以而有效降低过度的炎症反应，防止斑马鱼在急性细菌感染中产生的感染性休克症状，以而保护斑马鱼在原菌侵染中的存活率。本实验第一次揭示了鱼类卵黄高磷蛋白Pv衍生抗菌肽Pt5在鱼类对抗病原菌感染历程中所起到的免疫保护作用和免疫调节机制，具有杀死病原菌和降低炎症反应的双重功效。这一探讨结果具有重要的潜在运用价值。关键词：斑马鱼论文抗菌肽论文感染论文免疫调节论文机制论文
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Abstract7-9
缩略语9-12
第一章 文献综述12-44
1．鱼类免疫系统12-22

1.1 鱼类非特异性免疫12-13

1.2 鱼类的免疫器官和组织13-16

1.3 鱼类的免疫细胞16-18

1.4 鱼类体液免疫因子18-22

2．阳离子抗菌肽22-36

2.1 概述22-23

2.2 阳离子抗菌肽结构特点23-24

2.3 阳离子抗菌肽的分类24-26

2.4 阳离子抗菌肽的生物学活性26-31

2.5 抗菌肽的免疫调节活性31-34

2.6 作用机理34-36

3．鱼类细胞免疫因子36-42

3.1 概述36-37

3.2 干扰素(interferon, IFN)37-38

3.3 白细胞介素(inter论文导读：质粒的酶切鉴定55-563.2优化前的蛋白表达56-573.3自诱导条件下目的蛋白的表达57-583.4western-blot检测58-593.5表达蛋白的纯化593.6重组蛋白的体外抑菌活性59-604.讨论60-62第三章抗菌肽Pt5在鱼类急性感染中的免疫保护和调节作用62-811前言62-63

2.材料和策略63-681实验材料63-642斑马鱼败血症模型的建立64

leukin,IL)38-40
3.4 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)40-41

3.5 其它细胞免疫因子41-42

4 本论文的探讨目的及技术路线42-44
第二章 小分子量抗菌活性肽的大量原核表达44-62
1 前言44

2. 材料与策略44-55

2.1 实验材料44-46

2.2 实验菌株及菌株表达前活化与确认46-47

2.3 原核表达条件的优化47-50

2.4 SDS-PAGE 条件的改善50-51

2.5 表达蛋白的纯化及 western-blot 检测51-55

2.6 Pt5 和 M13 蛋白的体外抗菌活性检测55

3. 实验结果55-60

3.1 表达质粒的酶切鉴定55-56

3.2 优化前的蛋白表达56-57

3.3 自诱导条件下目的蛋白的表达57-58

3.4 western-blot 检测58-59

3.5 表达蛋白的纯化59

3.6 重组蛋白的体外抑菌活性59-60

4. 讨论60-62

第三章 抗菌肽 Pt5 在鱼类急性感染中的免疫保护和调节作用62-81
1 前言62-63

2.材料和策略63-68

2.1 实验材料63-64

2.2 斑马鱼败血症模型的建立64-65

2.3 抗菌肽 Pt5 对斑马鱼感染的保护实验65

2.4 抗菌活性蛋白 Pt5 对斑马鱼器官的保护性浅析65-66

2.5 外周血细胞血液学检测66-68

3 结果68-78

3.1 斑马鱼败血症模型68

3.2 斑马鱼细菌性感染败血症保护效果浅析68-70

3.4 Pt5 抑制细菌在感染败血症斑马鱼体内组织中扩散70-73

3.5 抗菌活性蛋白对感染斑马鱼外周血细胞的影响73-78

4.讨论78-81

4.1 腹腔注射 Pt5 对斑马鱼感染败血症中的保护作用78

4.2 腹腔注射 Pt5 对斑马鱼组织器官的染菌情况的影响78-79

4.3 腹腔注射 Pt5 对斑马鱼外周血各类白细胞数量的影响79-81

第四章 抗菌肽 Pt5 对斑马鱼免疫相关细胞因子的表达影响浅析81-101

1.前言81-82

2.实验材料与策略82-89

2.1 实验材料82

2.2 实验试剂82

2.3 实验仪器82-83

2.4 实验设计83

2.5 Realtime-PCR 引物设计与合成83-85

2.6 各组织总 RNA 的提取85-86

2.7 反转录制备 cDNA86-87

2.8 Real-time PCR 浅析87-89

3. 实验结果89-98

3.1 各组织各时期总 RNA 的质量89-91

3.2 RNA 样品中基因组 DNA 的消除及 cDNA 的检测91-92

3.3 定量 PCR 各引物的特异性检测92-93

3.4 促炎症因子基因在斑马鱼脾脏和肾脏中的表达93-96

3.5 抗炎症因子基因在斑马鱼脾脏和头肾中的表达96-98

4 讨论98-101

4.1 促炎症因子基因在斑马鱼脾脏和肾脏中的表达99-100

4.2 抗炎症因子基因在斑马鱼脾脏和肾脏中的表达100-101

结论101-102
参考文献102-111
致谢111-112
作者介绍112