浅论溶酶体H5N1型禽流感病毒损伤细胞溶酶体机制和南极极端环境下科考队员应激反应

论文导读：60蛋白与受体结合或者病毒包膜与细胞质膜融合而阻止病毒的进入,具有一定疗效；但目前因为未能对gp160蛋白进行晶体结构剖析而阻碍了新的更有效的病毒进入抑制剂的设计和研发;2009年gp160蛋白还被Nature杂志评为最需要进行晶体结构剖析的十个蛋白之一。其中表达纯化高质量的gp160蛋白是进行晶体结构剖析的重要前提。本课题综合
摘要：H5N1高致病性禽流感病毒不仅会给养殖、畜牧业带来灾难性的破坏,而H.人感染后死亡率高达近60%；特别是近期一些探讨结果表明H5N1禽流感病毒可以通过变异、重组而能在人群中传播,以而严重威胁人类的生命健康。而目前对H5N1禽流感病毒的致病机理仍然了解较少,禽流感病毒如何突破宿主细胞、免疫系统的防御而产生高病毒载量的机制还不明确,特别是具有清除外源微生物作用的溶酶体在流感病毒感染历程中的作用仍未得到剖析。本论文探讨发现H5N1禽流感病毒感染细胞后,病毒的神经氨酸酶(NA)能够在细胞内降解溶酶体膜上的糖蛋白和溶酶体内的水解酶,以而破坏溶酶体的完整性和正常功能,完整功能的溶酶体大量丧失可能是H5N1禽流感病毒的重要致病机制之一；而达菲等NA抑制剂能在细胞内抑制NA对溶酶体膜糖蛋白的降解,可能是其抗病毒的作用机制之一；同时也发现,不同程度上损伤溶酶体可能是流感病毒的共同致病机理。以上的探讨发现提示H5N1禽流感病毒可能通过破坏溶酶体功能以而引起高病毒载量、免疫抑制等严重病症,可能是H5N1禽流感病毒致病的重要理由；同时本探讨结果能为将来抗流感病物的研发提供新的思路和依据。表型和基因型关联浅析南极极端环境下科考队员的应激反应南极冰穹A (Dome A)位于南极大陆高原冰盖最高点,具有高海拔、低氧、酷寒、烈风、难以到达与危险性大等恶劣自然环境因素和与世隔绝的社会环境因素,被喻为地球上的“不可接近之极”之一；同时Dome A却是科学考察的圣地,每年都有大批科考队员前往Dome A进行例行的考察。长时间在南极生活工作,科考队员几乎都会出现不同程度的诸如冲动、烦躁、抑郁等症状的“南极综合症”,同时高原、低氧的环境会引起肺水肿、脑水肿等致命疾病,由此探讨南极Dome A复合多种极端环境对科考队员的生理、心理影响,并在分子机制上进行探究具有重要作用。我们以中国第24次南极内陆科考队员为探讨对象,浅析科考队员身处南极大陆最高点Dome A时的生理功能、心理情绪及外周血白细胞基因表达谱的变化。发现在Dome A时科考队员体现出显著的高原生理应激反应,体内雄性激素显著升高,并伴随心理情绪的异常波动,且雄性激素的升高与情绪波动具有显著相关性;外周血白细胞中差别表达的1,121个基因,在GO term数据库中富集得到有关大脑神经发育、精子生成等功能集,与表型中的情绪波动、脑血氧含量降低、性激素上升具有显著的相关性；基因芯片的浅析结果在一定程度上与表型中的生理、心理变化相对应。本探讨全面浅析了南极Dome A极端环境对人体的影响及部分表型变化的分子机制,能为将来科考队员的筛查、训练、防护和心理辅导提供重要的论述依据。HIV gp160蛋白高量表达与纯化人类免疫缺陷病毒(HIV)感染可以引起获得性免疫缺陷综合症(AIDS),感染者常常因为免疫缺陷引起继发性感染而死亡。目前全世界有超过3,000万的H1V感染者,同时每年还增加300万的新感染者,但还没有有效的疫苗和防治药物。HIV gp160蛋白构成了病毒外壳结构蛋白,介导了病毒的细胞进入以及宿主对病毒的抗体中和反应；多种病毒进入抑制剂通过干扰gp160蛋白与受体结合或者病毒包膜与细胞质膜融合而阻止病毒的进入,具有一定疗效；但目前因为未能对gp160蛋白进行晶体结构剖析而阻碍了新的更有效的病毒进入抑制剂的设计和研发;2009年gp160蛋白还被Nature杂志评为最需要进行晶体结构剖析的十个蛋白之一。其中表达纯化高质量的gp160蛋白是进行晶体结构剖析的重要前提。本课题综合了本实验室在蛋白表达纯化技术上的优势,通过对蛋白序列进行子优化,利用真核高表达载体,在人源293细胞中成功表达了gp160蛋白；并结合最新的We大规模细胞培养技术,实现了细胞的连续灌注培养；在进一步的探讨中通过在gp160蛋白末端加入T4F促三聚化末端,提升了gp160蛋白中的三聚体形式结合蛋白的比例。本探讨共计纯化表达了130mg gp160蛋白,为gp160蛋白抗体制备和结晶结构剖析等后续实验奠定了基础。同时,本探讨内容和策略为其它蛋白的高量表达和纯化提供了一个很好的平台。关键词：H5N1论文流感病毒论文溶酶体论文糖蛋白论文神经氨酸酶论文Dome论文A论文性激素论文情绪论文高原应激论文HIV论文gp160论文蛋白表达纯化论文
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图表目录8-10
中文摘要10-12
Abstract12-15
英文略语表15-18
第一部分 H5N1禽流感病毒感染引起细胞溶酶体损伤的机制探讨18-72
前言19-23

1.实验材料23-29

1.1 质粒23

1.2 菌株23

1.3 细胞株23-24

1.4 病毒株24

1.5 工具酶、酶切缓冲液及DNA Marker24

1.6 主要化学试剂24

1.7 细胞培养用耗材24

1.8 试剂盒24-25

1.9 主要仪器及设备25

1.10 主要溶液配方25-28

1.10.1 E.cop用培养基的配置25-26

1.10.2 抗生素的配制26

1.10.3 大量提取质粒DNA的相关溶液26

1.10.4 DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液及凝胶的配制26

1.10.5 细胞冻存液的配制26

1.10.6 细胞裂解液的配制26

1.10.7 SDS-PAGE蛋白质电泳及相关缓冲液的配制26-27

1.10.8 常用缓冲液的配制27-28

1.11 细胞培养试剂28

1.12 定量PCR相关试剂盒28

1.13 利用的主要抗体28

1.14 溶酶体标记染料和探针28-29

2. 实验策略29-39

2.1 细胞攻毒实验29

2.2 病毒感染后不同时间点细胞活力检测29

2.3 总RNA提取29-30

2.4 RNA逆转录成cDNA30-31

2.5 定量PCR检测基因表达变化31

2.6 基因表达质论文导读：胞内对溶酶体膜蛋白的降解依赖于其唾液酸酶活性53-543.15H5N1禽流感病毒感染后期能导致多种糖蛋白的表达下调54-553.16H5N1禽流感病毒感染CNE-2Z细胞后引起溶酶体膜蛋白表达下调55-573.17H5N1禽流感病毒NA导致溶酶体受损的机制示意图57-584.实验结果-2H5N1禽流感病毒感染细胞后产生的病毒来源的小RNA特点浅析58-674.1用
粒的构建31-32

2.7 溶酶体染色标记32

2.8 用流式细胞术检测溶酶体数量32

2.9 基因克隆32-36

2.9.1 引物稀释32-33

2.9.2 PCR扩增33

2.9.3 酶切消化33-34

2.9.4 连接34

2.9.5 转化34

2.9.6 鉴定34-35

2.9.7 质粒DNA的小提35

2.9.8 质粒DNA的大量提取35-36

2.9.9 重组质粒DNA浓度的测定36

2.10 贴壁细胞培养36

2.11 细胞冻存36-37

2.12 细胞复苏37

2.13 细胞裂解37

2.14 Western Blotting检测策略37-38

2.15 小RNA生物信息学浅析流程38-39

3. 实验结果-1：H5N1型禽流感毒感染引起细胞溶酶体损伤39-58

3.1 H5N1禽流感病毒感染引起A549细胞死亡39-40

3.2 H5N1禽流感病毒感染A549细胞后产生高病毒载量40-41

3.3 H5N1禽流感病毒感染A549细胞后病毒蛋白持续高表达41

3.4 H1N1和H5N1两种流感病毒感染细胞后能引起相同程度的凋亡41-42

3.5 H1N1和H5N1流感病毒感染A549细胞后自噬等相关信号通路检测结果42-43
3.6 H5N1禽流感病毒感染引起溶酶体膜蛋白LAMP1和LAMP2的下调43-45

3.7 H5N1禽流感病毒感染导致溶酶体分布分散和数量减少45-47

3.8 流感病毒感染后引起有功能的细胞溶酶体数量减少47

3.9 H5N1禽病毒感染A549细胞引起LAMPI和LAMP2基因表达的下调47-48
3.10 灭活H5N1禽流感病毒可以引起溶酶体膜糖蛋白LAMP2的表达下调48-49

3.11 灭活H5N1禽流感病毒引起有功能的溶酶体数量减少和分布弥散49-50

3.12 H5N1禽流感病毒的NA转染293T细胞后引起溶酶体膜蛋白下调50-52

3.13 不同病毒株的NA在细胞内都能引起溶酶体膜糖蛋白的降解52-53

3.14 NA在细胞内对溶酶体膜蛋白的降解依赖于其唾液酸酶活性53-54

3.15 H5N1禽流感病毒感染后期能导致多种糖蛋白的表达下调54-55

3.16 H5N1禽流感病毒感染CNE-2Z细胞后引起溶酶体膜蛋白表达下调55-57

3.17 H5N1禽流感病毒NA导致溶酶体受损的机制示意图57-58

4. 实验结果-2 H5N1禽流感病毒感染细胞后产生的病毒来源的小RNA特点浅析58-67

4.1 用于小RNA测序和转录组测序的RNA样品质量检测58-59

4.2 小RNA高通量测序文库制备结果59-60

4.3 小RNA高通量测序原始数据质量浅析结果60

4.4 小RNA高通量测序序列长度分布60-62

4.5 比对到病毒基因组的小RNA统计结果62-63

4.6 比对到病毒基因组的小RNA长度分布特点63-64

4.7 病毒产生的小RNA来源浅析64

4.8 H5N1禽流感病毒产生的小RNA主要分布在各个基因片段的两端64-66

4.9 H5N1禽流感病毒基因片段5'端来源的小RNA序列特点浅析66-67

结论67-68
讨论68-70
参考文献70-72
第二部分 极端环境下南极科考队员应激表型与基因型关联浅析72-116
前言73-75

1. 探讨对象和实验材料75-77

1.1 探讨对象和条件75-76

1.2 主要的设备仪器76

1.3 主要的试剂76

1.4 主要的材料76

1.5 利用的调查问卷76

1.6 统计策略76-77

2. 实验策略77-88

2.1 血气生化浅析检测77

2.2 肺功能检测77-79

2.3 心功能检测79

2.4 心电图测量79-80

2.5 脑血氧定量测量80

2.6 心理情绪问卷调查80

2.7 静脉血采集80-81

2.8 利用红细胞裂解液提取队员白细胞81

2.9 分离肝素抗凝血浆81

2.10 利用Epsa试剂盒检测内分泌因子81-82

2.11 血浆中细胞因了的检测82-83

2.12 RNA提取83

2.13 基因芯片检测83-86

2.14 基因芯片生物信息学浅析86

2.15 Pearson相关性浅析86-88

3. 结果88-112

3.1 科考队员前往Dome A考察时的自然环境记录结果88-89

3.2 受试者完成生理、心理测试和外周血收集情况89

3.3 血气检测结果89-90

3.4 肺功能测试结果90-92

3.5 心功能检测结果92-93

3.6 心电图检测结果93-94

3.7 内分泌因子检测结果94-96

3.8 细胞因子检测结果96-97

3.9 心理测试结果97-98

3.10 脑血氧检测结果98-101

3.11 生理、心理检测结果中有P值的表型列表101-102

3.12 有P值的表型同有P值的表型Pearson相关性浅析结果102-104

3.13 雄性激素testo与f-testo及雌性激素FSH的Pearson相关性浅析结果104

3.14 雄性激素testo与POMS的Pearson相关性浅析结果104-105

3.15 雌性激素FSH与情绪变化的Pearson相关性浅析结果105

3.16 基因芯片生物信息学浅析105-112

3.16.1 浅析路线105-106

3.16.2 数据标准化106

3.16.3 组内方差浅析及聚类106-108

3.16.4 差别表达浅析108

3.16.5 差别表达基因蛋白相互作用网络图绘制108

3.16.6 以GO数据库为浅析背景进行功能富集浅析结果108-110

3.16.7 富集得到的GO term关联网络110-111

3.16.8 富集得到的Go term中的差别表达基因同表型关联浅析结果111-112
结论112-113
讨论113-114
参考文献114-116
第三部分 HIV gp160蛋白的大量表达和纯化116-138
前言117-120

1. 实验材料120-123

1.1 质粒120

1.2 细胞株120-121

1.3 主要仪器及设备121

1.4 主要溶液配方121

1.5 PCR引物121-122

1.6 主要抗体122

1.7 细胞培养相关试剂122-123

2. 实验策略123-125

2.1 序列优化123论文导读：303.9在gp160末端加入三聚化末端后的表达载体检测结果130-1313.10gp160连接三聚化末端后对蛋白连接形式影响检测结果1313.11构建稳定表达gp160T4F融合蛋白的293F细胞株131-1323.12多种微载体在静止培养条件下培养293F细胞的细胞状态和表达量比较结果132-1333.13利用We细胞培养系统和微载体大量培养293F细胞的表达量检

2.2 DNA的线性化及纯化回收123

2.3 贴壁细胞培养123

2.4 稳定表达细胞株的构建123-124

2.5 蛋白纯化124-125

3. 实验结果125-135

3.1 gp160胞外段蛋白编码基因序列的子优化125-127

3.2 gp160基因克隆到pE13表达载体后的酶切鉴定结果127

3.3 gp160表达质粒瞬时转染细胞后的蛋白表达检测结果127-128

3.4 稳定表达细胞株的表达量检测结果128-129

3.5 人量培养293稳定表达细胞株表达gp160蛋白129

3.6 gp160Fc融合蛋白纯化后PAGE胶检测结果129

3.7 凝胶过滤层析检测gp160蛋白纯度结果129-130

3.8 在gp160表达基因末端加入T4F和GCNF促三聚化末端130

3.9 在gp160末端加入三聚化末端后的表达载体检测结果130-131

3.10 gp160连接三聚化末端后对蛋白连接形式影响检测结果131

3.11 构建稳定表达gp160T4F融合蛋白的293F细胞株131-132

3.12 多种微载体在静止培养条件下培养293F细胞的细胞状态和表达量比较结果132-133
3.13 利用We细胞培养系统和微载体大量培养293F细胞的表达量检测结果133-134

3.14 利用无血清培养基培养293F细胞表达gp160蛋白134-135

结论135-136
讨论136-137
参考文献137-138
综述：流感病毒与宿主细胞的相互作用机制138-153
参考文献149-153
致谢153-155
个人简历155-157