诊断慢性粒细胞白血病电化学生物传感器研究-科技

论文导读：ranormedintothestateofAu-ionbyREDOXreactionsandelectriccurrentwassensedbyelectroch摘自：毕业论文格式www.7ctime.comemicaldetection.ResultsThebestpairofaptamerswasselectedtodetecteCMLK562,thefittedcurveequationtotestcellsnumberandDPVofcurrentvaluewasobtai
[摘要] 目的 建立一种检测慢性粒细胞白血病的方法。 方法 此实验在已经筛选出慢性粒细胞白血病（CML）K562细胞5个特异性、结合率较高的核酸适体的基础上，构建了一种检测方法：采用两种纳米金属材料分别标记5个适体，将标记后的10个适体，两两组合与CML K562同时结合，一个作为捕获分子，一个作为测定分子与CML K562结合后，经氧化还原反应将测定分子上的金属转化成离子状态，利用电化学工作站检测对应的电流。 结果 筛选出了最佳组合（P2-S3-P1-S5）实现对CML K562的检测，得到了检测细胞数目与DPV电流值的拟合曲线方程。 结论 得到一种检测下限可达到50个细胞的诊断慢性粒细胞白血病的电化学生物传感器。
[关键词] 核酸适体；纳米材料；CML K562；电化学生物传感器
[] A[文章编号] 1673-7210（2012）08（b）-0014-03
Study of electrochemical biosensor for diagnosis chronic myeloid leukemia
LIU Wenwei ZHANG Xueyan XI Jing HAN Yuewu
Research Institute of Biochemistry, School of Basic Medical Science, Lanzhou University, Gansu Province, Lanzhou 730000, China
[Abstract] Objective To creat a method of detection for chronic myelocytic leukemia. Methods A method of detection had been built, based on an experiment in lab, during which, 5 highly-combined aptamers of CML K562 cells had been selected. Five aptamers were marked with two kinds of nanoparticles separately. The ten marked aptamers were divided into 20 pairs by every two combination. In every pair, the aptamers, one as the capture molecules, the other the determination molecules, were combined with CML K562 cells. Then the Au atoms were tranormed into the state of Au-ion by REDOX reactions and electric current was sensed by electroch摘自：毕业论文 格式www.7ctime.com
emical detection. Results The best pair of aptamers was selected to detecte CML K562, the fitted curve equation to test cells number and DPV of current value was obtained. Conclusion Get a electrochemical biosensor which can be used to diagnose CML K562 cells, with a detection limit up to 50 cells.
[Key words] Aptamers; Nanoparticles; CML K562; Electrochemical biosensor
目前以适体作为识别元件的生物传感器有光学适体生物传感器、电化学生物传感器、压电石英晶体生物传感器[1-4]。SELEX技术自问世已有20多年的发展历程，光学适体生物传感器和压电石英晶体生物传感器已相继有商品，但适体电化学传感器的研究还处于起步阶段，其中早期诊断慢性粒细胞白血病（CML）的电化学生物传感器也是一个空缺。笔者采用两种纳米材料分别标记5个适体，两两组合，一个作为捕获分子，一个作为测定分子与CML K562结合后，经氧化还原反应将测定分子上的金属转化成离子状态，利用电化学工作站检测电流[5-10]，筛选出最佳组合，结合适体与CML K562的结合率，可以判断结合的CML K562的数量，得到一种操作简单、灵敏度高、快速的早期诊断慢性粒细胞白血病的方法。
1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

CHI1210A电化学分析仪（CHI公司，美国）、原子吸收分光光度计、德国耶拿原子吸收光谱仪，型号ZEEnit700。
质粒抽提、PCR等试剂盒、100 bp DNA marker、胎牛血清（上海生工生物技术有限公司）生物素-链霉亲合素磁珠及磁力架、8种引物（上海生工生物技术有限公司）分别为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8：带羧基磁性纳米颗粒（平均粒径为30 nm）（巴溪仪器有限公司）；四氯金酸溶液（HAuCl4，上海中秦化学试剂有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 用氨基标记核酸适体S

1、S2、S3、S4、S5

根据ssDNA适体的序列选择各适体需要的上、下游引物经PCR扩增成5'端标记氨基和生物素的双链DNA。用生物素-链霉亲和素磁珠的方法分离，获得5'端标记氨基适体[4]。
1.2.2 用巯基标记核酸适体S

1、S2、S3、S4、S5学术论文下载www.7ctime.com

慢性粒细胞白血病是一种影响血液及骨髓的恶性肿瘤。主要的诊断方法有血象、骨髓象、中性粒细胞碱性磷酸酶检测（NAP）、细胞遗传学检测、分子遗传学检测等。然而，目前的分子诊断技术要求高，灵敏度不高，还无法在肿瘤发生的早期进行诊断，所以白血病的早期诊断是个亟待解决的问题。
随着慢粒早期诊断研究的不断深入，结合核酸适配子的特性，本实验在研究了大量的核酸适体、核酸适体生物传感器、核酸适体电化学生物传感器相关报道的基础上，结合本实验室已经筛选出的5个结合率高于40%的慢性粒细胞白血病适体，利用核酸适体易于标记的特点，结和胶体金技术，磁性纳米粒子两种纳米材料、电化学检测技术，用带羧基的磁性纳米粒子的已经标记有氨基的5个ssDNA核酸适配子和胶体金标记了巯基的5个ssDNA核酸适配子两两组合的适体，一个作为捕获分子，一个作为测定分子与CML K562结合后，利用磁铁将结合物固定在三电极系统分别为：玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝网辅助电极的丝网印刷电极传感器，经氧化还原反应将电极上的金原子转化成离子状态，利用电化学工作站检测对应的电流，筛选出最佳组合。利用最佳组合适体对与不同数量的CML K562结合，通过检测到的电流与CML K562的数量关系式，论文导读：ElectroanalChem，2001，510（1）：78-85.PlovV，XiaoY，ShlyahovskyB，etal.Aptamer-functionalizedaunanoparticleortheamplifiedopticaldetectionofthrombin.JAmChemSoc，2004，126（38）：11768-11769.Deisingh.Aptamer-basedbiosensors：biomedicalapplications.HandbExpPharmacol，200
利用软件做非线性回归分析结果得到拟合曲线方程：Y = －0.205X/（62.73+X），其中X为细胞数目，Y为DPV电流值。对慢性粒细胞白血病K562细胞的最低检测限可达到50个细胞。随着细胞数目的增加，DPV电流值增加，随后待适体均被结合以后基本到达一个平台，不再随着细胞数目的增加而增加。对样品重复测定10次，测得相对标准偏差RSD为

3.78%，从而得到一种操作简单、灵敏度高、快速的早期诊断慢性粒细胞白血病的方法。

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（收稿日期：2012-03-14本文编辑：张瑜杰）