探讨降解三氯苯酚降解相关基因合成与功能—PsUGT2I基因

论文导读：
摘要：三氯苯酚是一种含氯芳香环化合物,在自然界中难以降解,并对人类具有具有致癌、致畸、致突变的“三致”效应,有六种同分异构体。目前,化学和物理分解法不仅费用高昂,效果差,甚至还会产生二次污染,探讨还不是很改善。利用植物转基因技术,采取植物降解、微生物降解、或催化转化高毒性芳香化合物,将成为安全、快速、高效、经济的新型治理策略。糖基转移酶(Glycosyltranerase,简称GTs)超家族,在生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子,如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上,形成聚糖或糖蛋白、糖脂等的酶。有着于植物体内的糖基转移酶是参与糖苷化的重要成元。而糖苷化历程是次级代谢的重要步骤。已经有报道,植物利用此历程可以对含有苯环的芳香烃、氯代物具有转化、降解的功能。本探讨根据EMBL中公布的欧洲云杉(Picea Sitchensis)尿嘧啶-葡糖转移酶(UGT2夕基因,再依据植物子偏好性,利用PTDS法化学合成PsUGT2I基因。合成的PsUGT21基因翻译所得的氨基酸序列与网上公布的PsUGT2氨基酸序列一致。为了进一步浅析PsUGT2I基因的功能,首先构建双元表达载体,电击转化到农杆菌中。通过蘸花法转化拟南芥。经潮霉素筛选、PCR检测,得到了转基因阳性植株。对转基因植株的生理浅析表明,相对于野生型,PsUGT2I转基因拟南芥植株对2,4,5-TCP耐受性比较强；且转基因植株体现出较低的可溶性糖含量。同时,提取拟南芥蛋白液用作体外降解TCP浅析,发现转基因植物对2,4,5-TCP的降解转化能力有所提升。然后构建胞内表达载体,通过电击转化得到转基因的毕赤酵母,来进一步探讨PsUGT2I基因的功能。对于含有2,4,5-TCP的选择性培养基,转基因毕赤酵母具有更好的耐受性。液氮研磨法获得酵母蛋白,SDS-PAGE显示该蛋白分子量在54KDa；高效液相色谱层析法显示在体外情况下,一小时可以降解43.3%的2,4,5-TCP。本探讨可以为土壤污染的植物修复、微生物修复提供一个新的技术路线。关键词：糖苷转移酶论文UDP-GTs论文UGTs论文三氯苯酚论文高效液相色谱法(HPLC)论文植物降解论文微生物降解论文生物修复论文
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Abstract7-9
符号及縮略语说明9-11
第一章 文献综述11-25
引言11
1 葡萄糖基转移酶的性质、功能、催化机理及运用11-15

1.1 葡萄糖基转移酶的特点、分类与空间构型11-13

1.2 葡萄糖基转移酶的功能及催化机理13-14

1.3 葡萄糖基转移酶的运用14-15

2 三氯苯酚的概述15-21

2.1 三氯苯酚的性质及污染近况15-16

2.2 三氯苯酚的非生物降解探讨进展16

2.3 三氯苯酚的生物降解探讨进展16-21

3 常用合成目的基因的策略21-23

3.1 鸟法22

3.2 cDNA法22

3.3 PCR扩增法22

3.4 化学合成法22

3.5 直接分离法22-23

4 本探讨的目的、内容与作用23-25

4.1 探讨目的23

4.2 探讨内容23

4.3 探讨作用23-25

第二章 TCP降解基因PsUGT2I的合成及鉴定25-32
前言25
1 材料与策略25-27

1.1 材料25-26

1.2 实验策略26-27

2 结果与序列浅析27-31

2.1 PsUGT2I基因的合成27-29

2.2 目的基因29-30

2.3 PsUGT2I的序列浅析和蛋白浅析30-31

3. 讨论31-32

第三章 目的基因在植物中的表达32-51
引言32-33
1 材料与策略33-43

1.1 材料33-36

1.2 策略36-43

2 结果与浅析43-51

2.1 PsUGT2I农杆菌转化双元载体的构建43-44

2.2 PsUGT2I基因的拟南芥转化44-45

2.3 转基因拟南芥阳性植株的筛选45-47

2.4 转基因拟南芥阳性植株的PCR验证47-48

2.5 转基因拟南芥阳性植株的可溶性还原糖含量48-49

2.6 转基因拟南芥阳性植株的降解TCP情况49-51

第四章 目的基因在酵母中的表达51-65
引言51-52
1 材料与策略52-论文导读：591.1材料52-551.2策略55-592结果与浅析59-632.1酵母表达载体的构建59-602.2质粒载体的线性化验证602.3酵母阳性克隆的筛选60-612.4PsUGT2I蛋白浓度定量612.5PsUGT2I的电泳检测61-622.6HPLC法鉴定降解情况62-633讨论63-65参考文献65-71致谢71-72攻读学位期间发表的学术论文目录72-73上一页12
59

1.1 材料52-55

1.2 策略55-59

2 结果与浅析59-63

2.1 酵母表达载体的构建59-60

2.2 质粒载体的线性化验证60

2.3 酵母阳性克隆的筛选60-61

2.4 PsUGT2I蛋白浓度定量61

2.5 PsUGT2I的电泳检测61-62

2.6 HPLC法鉴定降解情况62-63

3 讨论63-65
参考文献65-71
致谢71-72
攻读学位期间发表的学术论文目录72-73