谈谈豚鼠人α防御素-5多肽抗单纯疱疹Ⅱ型病毒作用实验

论文导读：
摘要：单纯疱疹Ⅱ型病毒（herpes simplex virus type2，HSV-2）是一种常见的性传播病毒，生殖道是其主要的感染和侵入部位。HSV-2感染与先天性畸型、流产、宫颈癌等多种疾病相关，严重危害着人类健康，而现有的抗病物由于作用靶点较为单一，常发生HSV病毒耐药现象。由此，寻找新型、高效抗HSV病物具有重要的现实作用。防御素(Defensins)是一类内源性阳离子多肽，具有广谱抗病原微生物活性以及毒副作用小和病原体不易对其产生耐药等特点，有望被研发成为新一代的抗菌/抗病物。根据分子内二硫键的连接方式、前体性质以及表达部位的差别，哺乳动物防御素可分为α、β和θ防御素3种类型。目前在人体内共发现6种α防御素，根据表达部位和细胞来源的不同又分为髓源性和肠源性α防御素。人α防御素-5（human defensin5，HD-5）最初被认为主要由肠道Paneth细胞合成和分泌，但后来探讨发现在女性生殖道粘膜和男性尿道粘膜上皮也有HD-5的特异性表达。正是由于这些部位经常受到细菌和病毒等病原微生物的侵入，由环境压力造成的进化选择使得HD-5较其它防御素具有更为突出的抗病原微生物活性。正因如此，HD-5在细菌及病毒感染防治方面具有很好的运用前景，尤其是人们对于其在防治性传播病毒感染方面寄予了厚望。但有关HD-5的抗HSV-2感染作用机制还缺乏深入系统的探讨。为此，本论文采取常规病毒颗粒制备、细胞培养、细胞病变观察（CPE）、CCK-8浅析、HSV-2感染致豚鼠疱疹模型等策略，以体内和体外两个方面观察了HD-5多肽的抗HSV-2作用；同时还观察了血清及血清相关蛋白对HD-5多肽抗HSV-2作用的影响。具体内容包括：HSV-2病毒的制备及病毒滴度测定，CCK-8法和溶血试验检测HD-5多肽的细胞毒性，确定细胞无毒范围；然后以体外培养的Vero细胞为感染对象，以病毒粘附、侵入及复制等不同环节探讨HD-5多肽的抗HSV-2作用及其可能机制；同时，观察不同浓度血清对HD-5抗HSV-2作用的影响，并浅析血清白蛋白和胎球蛋白对HD-5抗病毒活性的抑制作用，探寻血清干扰HD-5功能发挥的主要理由；建立HSV-2感染致豚鼠疱疹动物模型，以豚鼠体重、存活率及存活时间、外阴症状变化为检测指标，观察体内运用HD-5多肽对HSV-2感染的救治作用。本论文取得了以下主要探讨结果及结论：（1）成功复制并鉴定HSV-2病毒，测定病毒滴度为TCID50=10-3.8。（2）在浓度≤100μg/ml范围内，HD-5多肽不会对Vero细胞的存活和增殖产生显著影响，显微镜下也未发现Vero细胞形态发生显著转变。（3）与完全溶血组比较，不同稀释度的HD-5多肽对小鼠红细胞均无溶血反应。（4）在病毒感染Vero细胞之前或同时加入HD-5多肽，可以剂量赖性地抑制HSV-2感染引起的细胞病变，在浓度为100μg/ml时，HD-5对HSV-2感染Vero细胞的保护率分别达到83.6±4.3%和89.4±3.3%；而在HSV-2感染2h后加入HD-5多肽对Vero细胞的保护作用不显著（P0.05），提示HD-5在体外具有突出的抗HSV-2感染活性，其作用机制主要是通过抑制病毒对细胞的粘附、侵入而发挥作用。（5）在体外抗病毒实验系统中加入血清时，HD-5多肽的抗HSV-2活性显著受到抑制，血清浓度越高，对HD-5活性的抑制作用越明星；进一步探讨发现，一定浓度的白蛋白和胎球蛋白也可以显著抑制HD-5的抗HSV-2活性，提示血清可以干扰HD-5抗病毒活性的发挥，其中白蛋白和胎球蛋白可能是血清干扰HD-5活性的两个主要成分。（6）成功建立了HSV-2感染豚鼠疱疹模型，给予HD-5多肽治疗可显著提升动物存活率、延长平均存活时间；以外阴症状变化来看，HD-5治疗组的临床症状轻且病情进展缓慢，其症状评分显著低于病毒感染对照组(P0.05)。提示HD-5多肽在体内也可以发挥显著的抗HSV-2感染作用。关键词：人α防御素-5（HD5）论文单纯疱疹Ⅱ病毒论文血清论文抗病毒作用论文豚鼠论文
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缩略语表5-6
英文摘要6-8
中文摘要8-10
前言10-12
第一章 人α防御素-5 多肽体外抗单纯疱疹Ⅱ型病毒作用探讨12-31

1.1 材料与试剂12-28

第一节 单纯疱疹Ⅱ型病毒的制备与鉴定16-21

1.1 实验策略16-18

1.2 结果18-21

第二节 人α防御素-5 多肽体外抗单纯疱疹Ⅱ型病毒作用浅析21-26

1.2.1 实验策略21-23

1.2.2 结果23-26

第三节 血清及血清相关蛋白对人α防御素-5 多肽抗单纯疱疹Ⅱ型病毒作用的影响26-28

1.3.1 实验策略26-27

1.3.2 结果27-28

1.2 讨论28-30

1.3 小结30-31

第二章 单纯疱疹Ⅱ型病毒感染豚鼠动物模型的建立及人α防御素-5 多肽的体内抗病毒感染作用探讨31-38

2.1 材料和试剂31-33

2.2 实验策略33-34

2.3 结果34-36

2.4 讨论36-37

2.5 小结37-38

全文总结38-40
参考文献40-42
文献综述42-53
参考文献49-53
攻读硕士学位期间发表的论文53-54
致谢54