浅议转导Dasatinib诱导人急性髓性白血病细胞分化药效及其机制学术

论文导读：sternblot检测细胞凋亡、周期和分化相关蛋白(PARP、Caspase3、Cleed-Caspase3、c-Myc、p21、p27、PU.1、C/EBPβ)的表达；运用硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验检测细胞分化能力；运用瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学转变；运用Real-timeP123456下一页
摘要：探讨目的：急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)的重要标志是严重的髓系分化障碍,由此诱导分化治疗是目前临床上针对AML的有效治疗对策。全反式维甲酸(All-trans retinoic acid, ATRA)是临床上首个用于治疗急性早幼粒白血病(Acute promeyloid leukemia, APL)的诱导分化剂,虽然治疗初期疗效显著,然而随着ATRA的利用,APL患者出现了不同程度的不良反应并对ATRA产生了耐受作用。由此,寻找新的高效低毒的诱导分化剂显得尤为重要。酪氨酸激酶抑制剂近年来引起了学者们的广泛关注和探讨,其中多个药物均被证实可以诱导AML细胞的分化。达沙替尼(Dasatinib)是第二代的小分子酪氨酸激酶抑制剂,已有探讨表明Dasatinib可以协同ATRA诱导AML细胞的分化,然而有关Dasatinib单独诱导AML细胞的分化作用及其分子机制却很少有被报道。有文献报道,STAT1在细胞随性分化历程中发挥着关键作用,但是,关于STAT1在Dasatinib诱导AML细胞分化中的作用并未见文献报道。同时,我们在实验历程中观察到了Dasatinib可以诱导AML细胞发生自噬,已有探讨表明细胞自噬可以影响细胞分化历程,然而AML细胞中自噬的发生与细胞分化之间的联系却未见报道。由此,本课题拟通过实验策略探讨Dasatinib诱导AML细胞的分化作用,并且进一步探讨可能有着的分子机制。探讨策略：选用人白血病细胞株HL60和NB4为探讨对象,考察Dasatinib对AML细胞的增殖和周期分布的影响,并检测Dasatinib诱导AML细胞分化的能力。采取台盼兰拒染法结合血细胞计数板计数来观察细胞增殖情况,描绘细胞生长曲线；细胞经Annexin V-PI双染后采取流式细胞术检测细胞凋亡情况；细胞经PI染色后采取流式细胞术浅析细胞周期的变化情况；细胞经CD11b-PE抗体结合后采取流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b表达；运用Western blot检测细胞凋亡、周期和分化相关蛋白(PARP、Caspase3、Cleed-Caspase3、c-Myc、p21、p27、 PU.1、C/EBPβ)的表达；运用硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验检测细胞分化能力；运用瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学转变；运用Real-time P论文导读：tinib能显著抑制HL60细胞的增殖,并且呈现一定的浓度依赖性和时间依赖性。采取流式细胞术检测细胞凋亡情况,并用westernblot法检测凋亡相关蛋白表达水平,结果显示,高浓度Dasatinib均能引起HL60细胞(30μM)和NB4(20μM)细胞的凋亡。流式细胞术浅析细胞周期情况,显示Dasatinib能使HL60细胞和NB4细胞的细胞周期阻滞在G1/G0期。人
CR检测细胞内分化相关因子(PU.1、C/EBPα、C/EBPβ)的mRNA表达水平；建立人白血病裸小鼠移植瘤模型评价Dasatinib的体内药效；选用人白血病细胞株HL60和NB4为探讨对象,考察Dasatinib诱导AML细胞分化的分子机制。细胞经CDllb-PE抗体结合后采取流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b表达；细胞经PI染色后采取流式细胞术浅析细胞周期的变化情况；运用NBT还原实验检测细胞分化能力；运用瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学转变；运用Western blot检测蛋白(PU.1、p-STAT1(S727)、p38、p-p38、JNK、 p-JNK、RARa、p-STAT1(Y701)、STAT1、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、T、 p-T、LC3)的表达；运用Real-time PCR检测细胞内CXCL-10、RIG-G、IRF-1的mRNA表达水平；运用免疫荧光法检测细胞内STAT1的定位变化；运用荧光素酶报告基因系统检测细胞内RARa的转录活性；运用丹酰戊二胺(MDC)染色策略检测细胞内自噬泡的分布情况。探讨结果：1)通过台盼兰拒染法结合血细胞计数板计数,显示Dasatinib能显著抑制HL60细胞的增殖,并且呈现一定的浓度依赖性和时间依赖性。采取流式细胞术检测细胞凋亡情况,并用western blot法检测凋亡相关蛋白表达水平,结果显示,高浓度Dasatinib均能引起HL60细胞(30μM)和NB4(20μM)细胞的凋亡。流式细胞术浅析细胞周期情况,显示Dasatinib能使HL60细胞和NB4细胞的细胞周期阻滞在G1/G0期。人白血病裸小鼠移植瘤模型评价Dasatinib的体内药效,结果显示,Dasatinib对AML细胞的体内增殖具有较好的抑制作用。2)检测细胞分化表面抗原标记物CDllb的表达,结果显示Dasatinib能够诱导HL60和NB4细胞发生分化,且呈时间和浓度依赖性联系,Dasatinib (10μM作用HL60细胞72小时后,CD11b阳性率为48%,Dasatinib (5μM)作用NB4细胞48小时后,CD11b阳性率达到了49%。瑞氏-吉姆萨的染色结果表明Dasatinib作用72小时后,HL60细胞和NB4细胞发生了髓系细胞方向的分化。NBT还原实验结果确证了Dasatinib诱导HL60细论文导读：因子的转录。以上这些实验结果都表明Dasatinib可以诱导AML细胞发生髓性分化。3)Westernblot结果表明Dasatinib作用后AML细胞中RARa的蛋白表达水平随时间进程显著下降。采取荧光素酶报告基因系统检测RARa荧光素酶活性,显示Dasatinib并不能激活RARa的转录。采取shRNA技术沉默HL60细胞中RARa蛋白的表达,将Dasatinib分别作用转
胞分化的能力。Real-time PCR以及western blot实验结果进一步证实了Dasatinib可以激活AML细胞中髓性分化相关因子的转录。以上这些实验结果都表明Dasatinib可以诱导AML细胞发生髓性分化。3) Western blot结果表明Dasatinib作用后AML细胞中RARa的蛋白表达水平随时间进程显著下降。采取荧光素酶报告基因系统检测RARa荧光素酶活性,显示Dasatinib并不能激活RARa的转录。采取shRNA技术沉默HL60细胞中RARa蛋白的表达,将Dasatinib分别作用转入了空载的HL60细胞和沉默了RARa的HL60细胞72小时,流式细胞术检测CD11b结果表明,Dasatinib诱导这两株细胞分化的能力没有发生转变。以上结果提示我们RARa在Dasatinib诱导的AML细胞的分化历程中可能没有发挥主要作用。4) Dasatinib作用HL60和NB4细胞不同时间后,STAT1蛋白的磷酸化水平被显著上调。DAPI染色结合免疫荧光定位结果显示,STAT1被磷酸化激活后由细胞质进入细胞核中,采取Real-time PCR检测STAT1下游因子CXCL-10、 RIG-G、 IRF-1的mRNA转录水平,结果证实STAT1发挥了转录调控作用。采取shRNA技术沉默HL60细胞中STAT1蛋白的表达,沉默后的HL60细胞经Dasatinib作用72小时后,CDllb阳性率由54%降到了39%,表明Dasatinib诱导的HL60细胞的分化被抑制,NBT还原实验和瑞氏-吉姆萨染色实验均证实了这一结果。Western blot结果显示,在Dasatinib诱导AML细胞分化的历程中,MEK/ERK蛋白的磷酸化水平显著上调。采取MEK抑制剂PD98059和Dasatinib共同作用AML细胞后(10μM Dasatinib作用HL60细胞72小时,5μM Dasatinib作用NB4细胞48小时),细胞内STAT1蛋白的磷酸化水平被显著下调,同时,流式细胞术检测CDllb的表达,结果显示HL60细胞中CDllb阳性率由单用Dasatinib的50%下降到了合用组的16%,NB4细胞中CDllb阳性率由单用Dasatinib的57%下降到了合用组的12%。以上结果提示我们,Dasatinib诱导的AML细胞的分化作用依赖于MEK/E论文导读：
RK通路调控的STAT1活性的增加。5) Dasatinib作用HL60和NB4细胞0、6、12、24和48小时后,采取western blot检测了自噬标记蛋白LC3的变化,结果表明LC3Ⅱ蛋白表达随时间逐渐增加,光密度浅析显示LC3Ⅱ/Ⅰ比值逐渐升高,作用48小时后差别显著。采取MDC染色检测细胞内自噬泡的产生和分布,结果表明,不论是HL60细胞还是NB4细胞中,Dasatinib作用6小时后,部分细胞内即出现示踪自噬泡的荧光点状分布,作用12小时后细胞核周围区域大量出现点状荧光分布,到24小时后更加显著。通过自噬抑制剂3MA、 Wortmannin和LY294002来下调AML细胞中的自噬水平,流式细胞术检测CDllb结果表明,Dasatinib诱导的AML细胞的分化也由此被抑制。相应地,通过自噬推动剂雷帕霉素(Rapamycin)来增加AML细胞中的自噬水平,Dasatinib诱导的AML细胞的分化水平则被显著上调。将较低浓度的Dasatinib和ATRA同时作用于HL60和NB4细胞,流式细胞术检测CD11b结果表明,Dasatinib能显著推动ATRA诱导的AML细胞的分化。采取MDC染色观察自噬泡的形成,结果显示在HL60和NB4细胞中,Dasatinib和ATRA共同作用的组别自噬泡大量出现并分散在细胞核周区域,由此可见,自噬可能参与了Dasatinib协同ATRA诱导AML细胞分化的历程。以上实验表明,Dasatinib可以诱导AML细胞发生自噬,这种自噬的发生伴随着整个髓性分化进程而有着,同时这种自噬的发生有利于AML细胞的分化。结论：本论文较为系统地讨论了Dasatinib诱导的AML细胞的分化作用,并对其中的分子机制做了初步探讨。探讨表明Dasatinib可以诱导AML细胞分化成为髓系细胞,并且MEK/ERK依赖性的STAT1的激活以及细胞内自噬水平的上调都可能有利于分化进程。本课题对Dasatinib诱导AML细胞分化的分子机制作了全新阐述,为Dasatinib在分化诱导治疗上的运用提供了实验依据,也为进一步改善和进展新型的白血病分化诱导治疗对策提供了论述基础。关键词：达沙替尼(Dasatinib)论文急性髓性白血病(AML)论文细胞分化论文信号转导和转录激活因子1(STAT1)论文细胞自噬论文
本论文导读：布31-323.15数据浅析32-334实验结果33-694.1Dasatinib可以抑制AML细胞的增殖33-354.2Dasatinib对AML细胞具有周期阻滞作用35-374.3Dasatinib可以诱导AML细胞的髓性分化37-434.4Dasatinib在体内可以抑制AML细胞的增殖43-454.5RARa在Dasatinib诱导的AML细胞的分化历程中没有发挥主要作用45-484.6Dasatinib通过激活STAT
论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。致谢4-5
中文摘要5-10
Abstract10-15
目录15-17
1 引言17-20
2 实验材料与仪器20-24

2.1 细胞株20

2.2 实验动物20

2.3 仪器20

2.4 药物与主要试剂20-24

3 实验策略24-33

3.1 细胞培养24

3.2 台盼兰拒染法检测Dasatinib抑制人白血病细胞增殖活性24

3.3 流式细胞术检测HL60和NB4细胞凋亡情况24

3.4 Western Blot检测相关蛋白24-26

3.5 流式细胞术检测HL60和NB4细胞周期的变化26

3.6 流式细胞术检测HL60和NB4细胞表面分化抗原表达情况26

3.7 瑞氏-吉姆萨染色观察AML细胞核形态变化26-27

3.8 NBT细胞还原能力测定27

3.9 实时荧光定量PCR测定细胞相关基因表达水平的变化27-29

3.10 人白血病裸小鼠移植瘤模型的建立及实验探讨29

3.11 双荧光素酶报告基因检测29-30

3.12 慢病毒颗粒的包装和细胞转染30-31

3.13 免疫荧光法观察STAT1在细胞内的定位情况31

3.14 丹酰戊二胺(MDC)染色检测自噬泡分布31-32

3.15 数据浅析32-33

4 实验结果33-69

4.1 Dasatinib可以抑制AML细胞的增殖33-35

4.2 Dasatinib对AML细胞具有周期阻滞作用35-37

4.3 Dasatinib可以诱导AML细胞的髓性分化37-43

4.4 Dasatinib在体内可以抑制AML细胞的增殖43-45

4.5 RARa在Dasatinib诱导的AML细胞的分化历程中没有发挥主要作用45-48

4.6 Dasatinib通过激活STAT1诱导AML细胞的髓性分化48-57

4.6.1 Dasatinib增强了STAT1的活性48-50

4.6.2 STAT1蛋白水平的下降抑制了Dasatinib诱导AML细胞分化的能力50-52
4.6.3 Dasatinib通过激活MEK/ERK的磷酸化增强STAT1的活性52-57

4.7 Dasatinib诱导的自噬可以推动AML细胞的髓性分化57-69

4.7.1 Dasatinib诱导AML细胞发生自噬57-59

4.7.2 细胞自噬水平的下论文导读：调抑制Dasatinib诱导的细胞分化59-644.7.3上调细胞的自噬水平可以协同增强Dasatinib的诱导分化作用64-664.7.4自噬可能参与了Dasatinib协同ATRA诱导AML细胞分化的历程66-695讨论69-73参考文献73-78综述78-90参考文献85-90作者介绍及硕士期间论文和会议摘要90-91上一页123456
调抑制Dasatinib诱导的细胞分化59-64
4.

7.3 上调细胞的自噬水平可以协同增强Dasatinib的诱导分化作用64-66

4.7.4 自噬可能参与了Dasatinib协同ATRA诱导AML细胞分化的历程66-69
5 讨论69-73
参考文献73-78
综述78-90
参考文献85-90
作者介绍及硕士期间论文和会议摘要90-91