论肾小管Kim-1小鼠模型构建及其肾纤维化机理

论文导读：血压、体重、存活率)情况,小鼠肾组织行电镜及免疫组化浅析。结果PCR基因型鉴定结果表明Kim-1REC-tg小鼠的出生率符合孟德尔比例,Kim-1REC-tg小鼠出生后肾脏组织即表达Kim-1mRNA及蛋白。新生Kim-1REC-tg小鼠肾脏重量及肾单位总数较对照组分别少23%和46%,但肾小球平均直径未见显著差别。新生小鼠肾脏病理学检查较对照组未见显著
摘要：探讨背景肾脏损伤因子-1(Kidney Injury Molecule1, Kim-1)是Ⅰ型跨膜糖蛋白,由甲肝病毒受体-1(Hcr-1)基因编码,其细胞外片段由一个粘液素功能区连接一个由六个半胱氨酸组成的球蛋白样功能区构成。正常情况下,肾脏组织几乎不表达Kim-1蛋白,但是在肾脏损伤后数小时内Kim-1的表达水平即显著升高。通过原位杂交和免疫组化浅析发现Kim-1主要表达于损伤后再生的去分化近端肾小管上皮细胞,尤其在近端小管S3段丰富的外髓质区域。探讨证实肾小管细胞损伤后,Kim-1蛋白的胞外片段在活化的MAP激酶作用下脱落到尿液中排出体外,通过检测尿液中Kim-1水平能够早期灵敏诊断急性肾损伤(Acute Kidney Injury, I)。近10余年来的临床前期及临床实验证实尿液Kim-1水平是I早期诊断及预后评估的灵敏指标。与多数传统利用的生物学指标相比较(血肌酐,血尿素氮等),Kim-1具有更高的灵敏度和特异性,其表达水平能够反映肾脏的实际病理损伤程度(具体可参考综述一)。目前,急性肾损伤网络(Acute Kidney Injury Network, IN)已经将尿液Kim-1列为I的领先诊断指标之一。近年来肾脏病学者发现Kim-1在肾小管损伤历程中不仅仅只是一个“结果体现”,同时也是肾脏病理损伤及修复历程的“参与者”。美国哈佛大学医学院Bonventre实验室发现在大鼠I发生后Kim-1能够促使肾小管上皮细胞向“半专业”吞噬细胞转化,以而发挥清除凋亡细胞和坏死组织碎片的作用。对I的病理生理机制探讨已经证实,坏死组织碎片的清除有利于肾小管上皮细胞的再生及小管重构,是I后炎症反应的重要环节,由此,Kim-1在I损伤一修复历程中具有重要的保护作用。然而,对慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease, CKD)的探讨发现,尿液Kim-1水平与部分CKD的发病及预后具有很高相关性,在Kim-1表达显著的区域,肾小管损伤、炎症反应及纤维化程度严重,提示Kim-1可能参与调控CKD的发生进展。以上探讨结果提示Kim-1在I及CKD的疾病历程中发挥不同的生物学作用,可能是调控急、慢性肾脏损伤转归的重要枢纽因子,但其具体分子机制仍不清楚。由此,深入探讨Kim-1在肾组织中的病理生理功能,将有助于更好了解CKD及肾脏纤维化的发病机制,并可能发现早期干预治疗的靶点。由于Kim-1在正常肾脏组织中几乎不表达,目前仍缺乏有效探讨Kim-1体内功能的动物模型。为此,本课题将通过构建肾小管上皮细胞条件性表达Kim-1蛋白的转基因小鼠模型,探讨Kim-1慢性表达对小鼠肾组织的影响及其相关分子机制。课题主要包括三部分：1.Kim-1小鼠模型的构建及表型鉴定；2.肾小管上皮细胞条件性表达Kim-1致肾脏炎症损伤及纤维化的机制探讨；3.mTOR信号通路介导Kim-1REC-tg小鼠肾间质纤维化的机制探讨。第一章：Kim-1小鼠模型的构建及其表型鉴定目的构建肾小管上皮细胞条件性表达Kim-1蛋白的转基因小鼠,探讨Kim-1慢性表达对小鼠肾脏的影响。策略通过Cre/Loxp位点重组酶原理构建转基因小鼠,首先体外构建依赖Cre重组酶活性表达的Kim-1及碱性磷酸酶(AP)线性基因片段(Z/Kim-AP)。显微注射策略将Z/Kim-AP基因片段导入FVB小鼠受精卵前核,将转基因后的受精卵植入假孕FVB雌鼠体内,三周后获得Z/Kim-AP转基因小鼠。Z/Kim-AP小鼠与Six2-GFPCre小鼠(Six2为启动子)杂交后获得皮质及外髓肾小管上皮细胞特异性表达Kim-1蛋白的双基因杂交鼠(Kim-1REC-tg)。PCR及免疫组化策略进行小鼠基因型鉴定。按PCR结果,筛选Kim-1阳性表达的Kim-1REC-tg小鼠,同窝Kim-1阴性小鼠作为对照组。根据实验设计,检测不同周龄小鼠的血肌酐(Scr)、电解质、红细胞比容(Hct)、尿蛋白、尿NAG、尿Kim-1及各项生理指标(血压、体重、存活率)情况,小鼠肾组织行电镜及免疫组化浅析。结果PCR基因型鉴定结果表明Kim-1REC-tg小鼠的出生率符合孟德尔比例,Kim-1REC-tg小鼠出生后肾脏组织即表达Kim-1mRNA及蛋白。新生Kim-1REC-tg小鼠肾脏重量及肾单位总数较对照组分别少23%和46%,但肾小球平均直径未见显著差别。新生小鼠肾脏病理学检查较对照组未见显著差别。两周龄Kim-1REC-tg小鼠病理学检查示局部小管空泡变性及上皮细胞退行性变,余肾小球、肾间质及肾血管未见显著异常。4周龄小鼠肾脏出现显著病理损伤,部分肾小管空泡变性,管腔扩张及蛋白管型形成,肾间质局部单个核细胞浸润,少量肾小球局灶性硬化。12周龄Kim-1REC-tg小鼠肾脏出现广泛炎性细胞浸润,肾小管细胞坏死脱落,大量蛋白及细胞管型形成,肾间质显著纤维化,弥漫性肾小球球性硬化。Kim-1REC-tg小鼠血肌酐水平在6-10周始较对照组显著升高,并进行性加重,多数Kim-1REC-tg小鼠在11周(中值)左右因自发性肾功能衰竭死亡。尿蛋白检测提示Kim-1REC-tg小鼠自4周始出现进行性加重的蛋白尿。Kim-1REC-tg小鼠同时合并慢性肾功能衰竭的并发症,包括贫血,低蛋白血症,高血压及水电解质紊乱。结论1.成功构建首个肾小管上皮细胞条件性过表达Kim-1蛋白的转基因小鼠；2.Kim-1REC-tg小鼠合并慢性肾功能衰竭的多种并发症,具有CKD进行性进展的典型疾病表型；3.肾小管上皮细胞条件性表达Kim-1诱导肾脏炎症损伤及纤维化,提示Kim-1是抗肾脏纤维化治疗的潜在靶点。第二章Kim-1慢性表达致肾脏炎症损伤及纤维化机制探讨目的探讨Kim-1慢性表达致肾脏进行性炎症损伤及纤维化的细胞学及分子生物学机制。策略免疫荧光染色评估不同年龄组小鼠F4/80阳性细胞的数目及分布情况。取不同年龄组Kim-1REC-tg小鼠肾皮质组织提取mRNA,采取实时荧光定量论文导读：REC-tg小鼠Kim-1阳性上皮细胞增生活跃。统计学浅析结果示2周龄、4周龄、12周龄Kim-1REC-tg小鼠肾皮质区Ki67阳性肾小管上皮细胞数均较对照组显著增加；4周龄Kim-1REC-tg小鼠Ki67阳性肾小球细胞数较对照组显著增加。realtime-PCR浅析结果示2周龄Kim-REC-tg小鼠肾皮质PDGF-b及TGF-p表达水平即出现升高,4周龄Kim-1REC-tg小鼠肾皮
PCR (realtime-PCR)浅析各组间生长因子(PDGF-b等)及炎症因子(TNF-α等)表达水平的差别。取4周龄Kim-1REC-tg小鼠,原代培养纯化分离后的肾小管上皮细胞,4-5天后收集细胞培养液,ELISA法检测TNF-α的表达水平。构建肾缺血再灌注损伤(IRI)小鼠模型,取损伤后72小时肾脏组织免疫组化共染色,浅析Ki67阳性细胞与Kim-1表达的分布联系。Kim-1REC-tg小鼠肾脏组织免疫组化染色,计数不同年龄组小鼠肾皮质区Ki67阳性的小管上皮细胞及肾小球细胞数,计数间质内CD3+细胞数。结果免疫荧光共染色结果显示,4周龄Kim-1REC-tg小鼠肾间质大量F4/80阳性细胞浸润,且多围绕Kim-1阳性肾小管,10周龄Kim-1REC-tg小鼠上面陈述的体现更显著。CD3+T细胞免疫组化染色及阳性细胞计数结果示,4周后的Kim-1REC-tg小鼠肾小管周-肾间质出现显著CD3±细胞浸润,12周后CD3+T细胞数显著增加,部分CD3+细胞迁移进入小管腔,上面陈述的结果提示Kim-1对炎症细胞具有显著趋化作用。realtime-PCR结果示2周龄Kim-1REC-tg小鼠肾皮质即出现炎症反应(IL-6、CXCL-1和MCP-1表达增高),4周龄Kim-1REC-tg小鼠肾皮质炎症级联反应加重,多种炎症因子表达水平显著上调,10周龄小鼠肾皮质多种炎症因子水平升高数十至数百倍,提示Kim-1诱导Kim-1REC-tg小鼠肾组织进行性加重的炎症反应。4周龄Kim-1REC-tg小鼠原代肾小管上皮细胞的培养液中TNF-α水平较对照组显著升高,进一步支持表达Kim-1的肾小管上皮细胞分泌炎症因子促发肾脏炎症级联反应。肾缺血再灌注损伤72小时小鼠肾组织免疫组化共染色结果示Kim-1阳性肾小管上皮细胞同时表达Ki67,提示I后Kim-1阳性肾小管上皮细胞增生活跃。免疫组化结果示部分2周龄Kim-1REC-tg小鼠肾脏囊肿形成,囊腔上皮细胞共表达Kim-1及Ki67；4周龄Kim-1REC-tg小鼠肾皮质区Kim-1阳性肾小管同时高度表达Ki67,提示Kim-1REC-tg小鼠Kim-1阳性上皮细胞增生活跃。统计学浅析结果示2周龄、4周龄、12周龄Kim-1REC-tg小鼠肾皮质区Ki67阳性肾小管上皮细胞数均较对照组显著增加；4周龄Kim-1REC-tg小鼠Ki67阳性肾小球细胞数较对照组显著增加。realtime-PCR浅析结果示2周龄Kim-REC-tg小鼠肾皮质PDGF-b及TGF-p表达水平即出现升高,4周龄Kim-1REC-tg小鼠肾皮质EGF、FGF、PDGF-b、CTGF及TGF-p的表达均显著高于对照组,以上结果提示Kim-1表达刺激肾皮质细胞大量合成多种生长因子,导致肾组织细胞增生活跃,肾单位结构功能异常。结论1、表达Kim-1的肾小管上皮细胞持续分泌TNF-α等前炎症因子,诱导炎症细胞迁徙浸润,导致进行性加重的肾脏炎症损伤；2、Kim-1介导肾小管上皮细胞合成多种生长因子,导致肾组织细胞异常增生,肾单位结构和功能异常；3、Kim-1慢性表达诱导Kim-1REC-tg小鼠肾间质持续炎症损伤及进行性纤维化,提示Kim-1是肾纤维化的潜在治疗靶点。第三部分mTOR信号通路介导Kim-1REC-tg小鼠肾间质纤维化的机制探讨目的探讨mTOR信号通路在Kim-1慢性表达致Kim-1REC-tg小鼠肾间质纤维化历程中的调控作用。策略realtime-PCR及免疫组化策略浅析2-5周龄Kim-1REC-tg小鼠肾皮质组织mTOR信号通路中各效应因子的表达情况。4周龄Kim-1REC-tg小鼠随机分为治疗组(n=6)及安慰剂组(n=6),同窝Kim-1阴性小鼠作为空白对照组(n=5),治疗组小鼠腹腔注射雷帕霉素(2mg/kg/day),安慰剂组腹腔注射等量生理盐水。6周后分别检测两组小鼠尿蛋白及血肌酐水平,肾脏组织病理切片评估肾脏损伤程度,western-blot检测pS6K及αA表达水平,realtime PCR检测肾组织炎症因子表达水平,肾组织免疫组化染色浅析肾皮质pS6K表达特点及F4/80阳性细胞、αA阳性细胞浸润情况,分别计数各组小鼠肾组织中Ki67阳性细胞及CD3阳性细胞。结果realtime-PCR结果显示2周龄Kim-1REC-tg小鼠肾皮质组织T、mTOR及e1F4E-BP3的mRNA表达较同窝对照组显著增高,4周龄Kim-1REC-tg小鼠肾皮质组织中mTOR通路多个效应因子水平均显著增高。免疫组化浅析示4周龄Kim-1REC-tg小鼠大量肾小管上皮细胞及肾间质细胞表达pS6K,提示Kim-1REC-tg小鼠肾组织mTOR通路显著激活。雷帕霉素治疗6周后,Kim-1REC-tg小鼠尿蛋白及血肌酐水平较对照组显著降低,肾脏病理学检查示治疗组小鼠肾小管损伤较对照组显著减轻。Western blot及免疫组化浅析示与对照组相比,治疗组小鼠肾组织pS6K及αA的表达水平显著下调,肾间质F4/80阳性细胞数显著减少,肾间质纤维化程度显著减轻,Ki67阳性细胞及CD3+细胞数均较对照组显著减少,雷帕霉素显著减轻Kim-1REC-tg小鼠肾脏炎症损伤及纤维化程度。结论1、肾小管上皮细胞条件性表达Kim-1蛋白诱导肾组织mTOR信号通路显著活化；2、特异性抑制mTOR信号通路能够显著减轻Kim-1REC-tg小鼠肾脏炎症损伤及肾间质纤维化程度,具有显著的肾脏保护作用,本章结果提示mTOR信号通路是Kim-1诱导肾脏纤维化的重要效应通路。关键词：肾脏损伤分子1论文肾小管上皮细胞论文纤维化论文炎症因子论文mTOR论文
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Abstract12-22
英文缩略论文导读：.2结果56-672.3讨论67-692.4小结69-70第三章mTOR信号通路介导Kim-1~(REC-tg)小鼠肾纤维化的机制探讨70-823.1材料与策略71-733.2结果73-803.3讨论80-813.4小结81-82全文总结82-83参考文献83-89综述一89-101参考文献96-101综述二101-111参考文献107-111致谢111-112攻读学位期间主要探讨成果112上一页1
词表22-24
第一章 Kim-1小鼠模型的构建及其表型鉴定24-50

1.1 材料与策略25-36

1.2 结果36-47

1.3 讨论47-49

1.4 小结49-50

第二章 Kim-1慢性表达致肾脏炎症损伤及纤维化的机制探讨50-70

2.1 材料与策略51-56

2.2 结果56-67

2.3 讨论67-69

2.4 小结69-70

第三章 mTOR信号通路介导Kim-1~(REC-tg)小鼠肾纤维化的机制探讨70-82

3.1 材料与策略71-73

3.2 结果73-80

3.3 讨论80-81

3.4 小结81-82

全文总结82-83
参考文献83-89
综述一89-101
参考文献96-101
综述二101-111
参考文献107-111
致谢111-112
攻读学位期间主要探讨成果112