探讨白蛋白长效人血清白蛋白制备及其生物功能与药代动力学

论文导读：
摘要：人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)是人血浆中含量最丰富的蛋白质,浓度可达42±3.5g/L。HSA提供80%的血浆胶体渗透压(colloid ootic pressure, COP),其临床药效主要为血容量扩充、维持血浆胶体渗透压和血液稀释等。HSA临床适应症广泛,包括血容量不足、出血性休克、烧伤、白蛋白减少症、急性肝损伤、腹水、外科手术、急性呼吸窘迫综合征和血液透析等。近年来,由于血液来源短缺等理由致使HSA供应十分紧张,如何解决HSA的来源紧缺不足已成为目前HSA探讨的热点。基于此,科研工作者主要围绕以下两个方面展开探讨,寻找HSA的替代品,一是利用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)对非人源白蛋白进行修饰以消除其免疫原性,但其安全性让人担忧；二是利用基因重组技术生产重组人血清白蛋白(recombinant HSA, rHSA)。目前,HSA已在细菌、真菌、植物及动物中成功表达,但由于HSAI临床运用剂量较大(每次可达5-10g)和rHSA产率较低等理由,实现高纯度、低成本的药物级rHSA的大规模生产是个极具挑战性的课题。此外,HSA的临床运用也有着一定局限性。如在烧伤、感染或失血等病理情况下,血管内皮细胞损伤,毛细血管通透性增加,血容量下降,及时有效地进行血容量扩充非常重要。然而毛细管渗透性增加可加速HSA的血管外渗,导致HSA血容量扩充作用维持时间较短,引起或加重组织水肿,不利于病情缓解。针对以上HSA来源短缺和血管保留率低等不足,本课题设想：采取PEG对HSA进行共价修饰,PEG分子具有巨大的水化体积,与HSA偶联后将赋予HSA较大的分子半径,以而减少血管渗漏,增加外源性输注的HSA的血管保留率使其充分发挥血容量扩充作用；同时PEG修饰能显著改善蛋白质药物的药代动力学性质,对HSA进行PEG修饰有望延长其生物半衰期,降低用药频率,在药物经济学方面也具有一定作用。本课题的主要探讨内容及取得的成果有以下几个方面：1HSA的分离纯化及PEG定点和随机修饰产物的制备PEG修饰反应原料的纯度与修饰产物的均一性和反应产率密切相关,为了提升反应产率获得均一性良好的PEG修饰产物,本实验采取Sephacryl S-200凝胶柱层析和超滤法对血浆来源的HSA进行分离纯化。利用HSA分子上唯一的半胱氨酸残基,以相对分子质量(Mr)为20kDa的单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺(mPEG-MAL)为修饰剂,对HSA进行Cys34定点修饰；利用N-末端氨基酸残基上的α-氨基和HSA主链上赖氨酸上的ε-氨基的pKa值不同,以单甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)为修饰剂,对HSA进行N-末端定点修饰。采取单因素浅析和正交试验优化反应条件,确定最佳反应条件。修饰产物经DEAE Sepharose FF柱层析和超滤法两步分离纯化,获得Cys34定点修饰产物(PEG-cys34HSA)和N-末端定点修饰产物(N-terminal PEG-HSA)。同时采取氰尿酰氯活化的PEG对HSA进行随机修饰,制备Mr相当的随机修饰产物(random PEG-HSA),以作为体内外性质测定的对照品。结果显示,Sephacryl S-200凝胶柱层析和超滤法两步纯化可显著提升HSA纯度,HSA的纯度由纯化前的91%提升到99.8%。mPEG-MAL与HSA的最佳反应条件经单因素浅析确定为：pH6.5、50mmol/L磷酸盐缓冲液(含10mmol/L EDTA); HSA浓度为5mg/mL; HSA:PEG摩尔比为1：2；37℃水浴摇床振摇20h,该最佳反应条下修饰产率达到50%以上。经SDS-PAGE检测粗略估计修饰产物的Mr约为90kDa,证实该修饰产物为单修饰产物。mPEG-ALD与HSA的最佳反应条件为：pH6.0、10mmol/L磷酸盐缓冲液；HSA:PEG摩尔比为1：3；HSA浓度为5mg/mL;在反应结束前6h加还原剂NaCNBH3;4℃反应36h。按照以上优化的反应条件制备的HSA的N-末端定点修饰产物(N-terminal PEG-HSA)均一性好,SDS-PAGE检测单修饰率可达35%。PEG-cys34HSA和N-terminal PEG-HSA经DEAE Sepharose FF柱层析和超滤法两步法纯化所得样品经SDS-PAGE检测纯度可达95%和91%。氰尿酰氯活化的PEG-6000与HSA的修饰产物分子量分布广泛,采取DEAE Cellulose柱层析和超滤法获得平均分子量约为90kDa左右的随机修饰产物,与定点修饰产物Mr相当,可作为体内外性质测定的对照品。2HSA及其PEG修饰产物的性质测定对HSA及其PEG修饰产物(PEG-cys34HSA、N-terminal PEG-HSA和random PEG-HSA)的理化性质和修饰参数进行浅析鉴定,主要包括修饰产物的二级结构、分子量、修饰位点和流体力学半径等。结果显示：利用圆二色谱法(CD)测定HSA及其PEG修饰产物的二级结构变化情况,修饰前后HSA的CD图谱峰形类似,几乎完全重合,这说明两者的二级结构几乎完全一致,提示PEG修饰并未影响HSA的二级结构；采取动态激光散射法(DLS)测得HSA、PEG-cys34HSA和N-terminal PEG-HSA的流体力学半径(Rh)分别为7.81、47.25和50.74nm, HSA经PEG修饰后,Rh增加为原来的6-6.5倍,HSA在水溶液中的流体力学半径显著提升；采取N-乙基马来酰亚胺(NEM)封闭法确定PEG-cys34HSA的修饰位点,SDS-PAGE证实NEM处理的HSA不能发生PEG化反应,以此证实修饰反应发生在唯一个游离半胱氨酸-34位半胱氨酸；采取高效凝胶渗透色谱-多角度激光散射联用法(GPC-MALS)测定N-terminal PEG-HSA的Mr为83.71kDa,确定该修饰产物为单修饰产物。3HSA及其PEG修饰产物的药物结合性质探讨HS论文导读：)的消除半衰期(t1/2β)分别为9.51±2.22、21.91±2.00、22.50±1.70和22.93±1.51h,PEG修饰后t1/2柏延长为未修饰前的2.3-2.4倍左右。同时可以观察到,修饰产物的药时曲线下面积(AUC)和平均保留时间(MRT)都较未修饰前增大,血浆清除率(CL)也有所降低,以上结果均提示PEG修饰能够改善HSA在体循环的保留率。各修饰产物与HSA相比,各时间
A是人血浆中含量最为丰富的一种载体蛋白,探讨药物与HSA及其修饰产物的结合性质,对于了解药物在体内的转运、分布以及代谢历程具有重要作用。本实验采取表面等离子共振技术(SPR)探讨了两种模型药物(华法林和萘普生)与HSA及其PEG修饰产物的相互作用。结果显示,SPR技术能够准确反映HSA及其PEG修饰物与药物的结合水平。采取解离平衡常数(KD)衡量配基(华法林和萘普生)与受体(HSA及其PEG修饰产物)的相互结合能力,硒值愈小结合能力愈大。华法林与HSA、 PEG-cys34HSA、N-terminal PEG-HSA和random PEG-HSA相互作用的KD值分别为：12.9、24、14.2和67.6μmol/L,萘普生与HSA、PEG-cys34HSA、N-terminal PEG-HSA和random PEG-HSA相互作用的KD值分别为24.6、36、27.7和44.7μmol/L。不同修饰位点对结合能力影响不尽相同,定点修饰对HSA与药物结合影响作用较小,与Cys34定点修饰相比,N-末端氨基定点修饰对HSA与药物的亲和力影响较小。而随机修饰由于其修饰位点较多且修饰位点不确定,能够显著降低HSA与药物的亲和力。4人血清白蛋白及其PEG修饰产物在小鼠体内的药代动力学和组织分布探讨本实验采取1251放射标记法和三氯乙酸(TCA)沉淀法探讨HSA及其PEG修饰产物在小鼠体内的血浆半衰期和组织分布等性质。结果显示,HSA及其PEG修饰产物在小鼠的体内历程符合二室模型,HSA、PEG-cys34HSA、N-terminal PEG-HSA和random PEG-HSA(?)的消除半衰期(t1/2β)分别为9.51±2.22、21.91±2.00、22.50±1.70和22.93±1.51h,PEG修饰后t1/2柏延长为未修饰前的2.3-2.4倍左右。同时可以观察到,修饰产物的药时曲线下面积(AUC)和平均保留时间(MRT)都较未修饰前增大,血浆清除率(CL)也有所降低,以上结果均提示PEG修饰能够改善HSA在体循环的保留率。各修饰产物与HSA相比,各时间点的组织分布量相当,并未显示显著的组织分布特异性。5HSA及其PEG修饰产物在急性肺损伤模型中的毛细血管透过率和对脓毒症的药效学探讨本实验采取内毒素脂多糖(LPS)吸入给药诱导小鼠急性肺损伤(ALI)模型,引起肺部毛细血管通透性增加,考察HSA及其PEG修饰产物在肺部毛细血管的渗出；利用LPS尾静脉注射诱导大鼠脓毒血症模型,以大鼠的红细胞压积(Hct)和平均动脉压(MAP)为考察指标,评价PEG-cys34HSA对大鼠脓毒血症的治疗作用。肺部毛细血管的透过率结果显示,三种修饰产物给药组的血管渗出量显著低于HSA,提示PEG修饰可有效减少HSA向肺实质的渗漏。HSA和定点修饰产物PEG-cys34HSA对脓毒血症的药效学探讨结果显示,LPS给药后2h,各组的Hct均呈现上升走势,MAP也呈现大幅度下降,降幅大于40mmHg,以上结果提示造模成功。HSA与PEG-cys34HSA给药后2h, HSA给药组的MAP由92±6mmHg上升为98±15mmHg,而PEG-cys34HSA给药组的MAP由92±12mmHg升至117±7mmHg,上升幅度显著高于HSA组(P0.05)。同时,各组在给与液体输注后2h,Hct均有所降低,体现为血液稀释,血容量升高,其中PEG-cys34HSA血液稀释作用强于生理盐水组和HSA组(P0.05),提示PEG-cys34HSA可更有效地扩充血.容量。本探讨取得的主要成果和结论：1.采取mPEG-MAL和nPEG-ALD为修饰剂,与HSA反应能够获得均一的定点单修饰产物,修饰反应条件温和、操作简单、重复性好、单修饰率较高。采取DEAE Sepharose FF柱层析和超滤法两步纯化可获得纯度较高的修饰产物。2.PEG修饰对HSA的二级结构影响较小,可显著增加修饰蛋白的水化半径。3.不同修饰位点对PEG修饰产物与小分子药物的结合能力影响不尽相同,定点修饰对HSA与药物结合影响作用较小,而随机修饰能够显著降低HSA与药物的亲和力。4.PEG修饰可延长HSA的消除半衰期,改善其血管保留时间,对HSA的组织分布影响不大。5.在LPS诱导的肺部毛细血管通透性增加的情况下,PEG修饰可减少HSA的血管透过率,由此有利于缓解水肿。在脓毒症模型的治疗中,PEG-cys34HSA能够更有效地回升血压和扩充血容量。关键词：人血清白蛋白论文PEG修饰论文药物结合论文药代动力学论文血容量扩充论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。中文摘要16-21
ABSTRACT21-25
符号说明25-27
第一章 前言27-50
1 HSA的性质和结构27-28
2 HSA的体内合成、分布和代谢28-30
3 HSA的生理功能30-32

3.1 维持胶体渗透压30

3.2 结合和运输作用30-31

3.3 抗氧化作用31

3.4 循环保护作用31-32

3.5 毛细血管膜通透性调节作用和神经保护作用32

4 HSA的结合性质32-34

4.1 脂肪酸结合位点32-33

4.2 药物结合位点33-34

4.3 甲状腺素结合位点34

4.4 金属离子结合位点34

5 HSA的来源34-36

5.1 人血浆来源的HSA34-35

5.2 重组人血清白蛋白35-36

6 HSA的临床运用和有着的不足36-38

6.1 临床运用36

6.2 HSA在临床运用方面的局限性36-38

7 HSA的结构改造38-39

7.1 半衰期延长的HSA变异体38

7.2 具有抗菌活性的HSA变异体38

7.3 具有抗氧化特性的HSA变异体38-39

7.4 携氧型HSA突变体39

8 蛋白质和多肽的PEG修饰反应39-45
8.1 PEG随机修饰40
8.2 PEG定论文导读：其PEG修饰产物与小分子药物的亲和力测试99-1023结果102-1163.1蛋白质的浓度测定102-1033.2HSA与药物的稳态亲和测试103-1083.EG-cys34HSA与药物的稳态亲和测试108-1113.4N-terminalPEG-HSA与药物的稳态亲和测试111-1133.5RandomPEG-HSA与药物的稳态亲和测试113-1164讨论及结论116-118第五章人血清白蛋白及其修饰
点修饰40-45
9 PEG修饰产物的分离纯化45-47
9.1 分子排阻层析45-46
9.2 疏水作用层析46
9.3 离子交换层析46-47
9.4 超滤47
10 PEG修饰剂和PEG化蛋白的浅析鉴定47-49
10.1 PEG修饰剂的浅析鉴定47-49
10.2 PEG-蛋白结合物的的浅析鉴定49
11 本课题拟解决的不足49-50
第二章 人血清白蛋白的分离纯化及其聚乙二醇修饰产物的制备50-87
第一节 人血白蛋白的分离纯化50-56
1 材料50-52

1.1 试剂50-51

1.2 仪器51

1.3 溶液配制51-52

2 策略52-53

2.1 Sephacryl S-200凝胶柱层析对HSA的分离纯化52

2.2 超滤52

2.3 SDS-PAGE检测纯度52-53

3 结果53-55

3.1 Sephacryl S-200凝胶柱层析对HSA的分离纯化53

3.2 纯度检测53-55

4 结论55-56
第二节 人血清白蛋白Cys34定点PEG修饰反应及修饰产物的分离纯化56-64
1 材料56-57

1.1 试剂56

1.2 仪器56

1.3 溶液配制56-57

2 策略57-59

2.1 Cys34定点PEG修饰反应条件的优化57-58

2.2 PEG-cys34HSA的分离纯化58-59

3 结果59-62

3.1 最佳修饰条件的确定59-60

3.2 PEG-cys34HSA的分离纯化60-62

4 讨论62-63
5 结论63-64
第三节 人血清白蛋白N-末端氨基的PEG定点修饰及修饰产物的分离纯化64-79
1 材料64-65

1.1 试剂64

1.2 仪器64

1.3 溶液配制64-65

2 策略65-67

2.1 N-末端氨基的PEG定点修饰反应条件的优化65-67

2.2 N-末端氨基的PEG定点修饰产物的分离纯化67

3 结果67-77

3.1 N-末端氨基的PEG定点修饰反应条件优化67-76

3.2 N-末端氨基PEG定点修饰产物的分离纯化76-77

4 讨论77-78
5 结论78-79
第四节 人血清白蛋白的随机修饰及修饰产物的分离纯化79-87
1 材料79

1.1 试剂79

1.2 仪器79

2 策略79-81

2.1 PEG-6000的活化79

2.2 人血清白蛋白的随机修饰反应79-80

2.3 不同修饰率的随机修饰产物的分离纯化80-81

2.4 自由氨基修饰率测定81

3 结果81-86

3.1 PEG-6000的活化81

3.2 人血清白蛋白的随机修饰反应81-84

3.3 不同修饰率的随机修饰产物的分离纯化84-85

3.4 自由氨基修饰率测定85-86

4 讨论及结论86-87
第三章 人血清白蛋白及其修饰产物的性质测定87-96
1 材料87

1.1 试剂87

1.2 仪器87

1.3 溶液配制87

2 策略87-89

2.1 HSA及其修饰产物的二级结构87-88

2.2 HSA及其修饰产物的流体力学半径88

2.3 PEG-cys34HSA修饰位点确定88

2.4 N-terminal PEG-HSA的分子量测定88-89

3 结果89-94

3.1 HSA及其修饰产物的二级结构89-90

3.2 HSA及其修饰产物的流体力学半径90-91

3.3 PEG-cys34HSA的修饰位点鉴定91-92

3.4 N-terminal PEG-HSA的相对分子量的确定92-94

4 讨论及结论94-96
第四章 人血清白蛋白及其修饰产物的药物结合性质探讨96-118
1 材料96-98

1.1 试剂96

1.2 仪器96-97

1.3 溶液配制97-98

2 策略98-102

2.1 HSA及其PEG修饰产物与CM5芯片的偶联98-99

2.2 HSA及其PEG修饰产物与小分子药物的亲和力测试99-102

3 结果102-116

3.1 蛋白质的浓度测定102-103

3.2 HSA与药物的稳态亲和测试103-108

3.3 PEG-cys34HSA与药物的稳态亲和测试108-111

3.4 N-terminal PEG-HSA与药物的稳态亲和测试111-113

3.5 Random PEG-HSA与药物的稳态亲和测试113-116

4 讨论及结论116-118
第五章 人血清白蛋白及其修饰产物在小鼠体内的药代动力学和组织分布探讨118-130
1 材料118-119

1.1 试剂118

1.2 仪器118

1.3 动物118-119

2 策略119-120

2.1 HSA及其修饰产物的~(125)I放射性标记119-120

2.2 供试液的配制与给药120

2.3 HSA及其修饰物在小鼠体内药代动力学和组织分布探讨120

2.4 结果统计学浅析120

3 结果120-127

3.1 HSA及其修饰产物的标记结果120-122

3.2 HSA及其修饰产物在小鼠体内的药代动力学和组织分布探讨122-127

4 讨论127-129
5 总结129-130
第六章 人血清白蛋白及其聚乙二醇修饰产物在急性肺损伤模型中的毛细血管透过率和对脓毒症的药效学探讨130-143
1 材料130-131

1.1 试剂130-131

1.2 仪器131

1.3 动物131

2 策略131-134
2.1 HSA及其PEG修饰产物在急性肺损伤模型中的毛细血管透过率探讨131-133
2.2 HSA和定点修饰产物PEG-cys34HSA对脓毒血症的药效学探讨133-134
3 结果134-139
3.1 HSA及其PEG修饰产物在急性肺损伤模型中的毛细血管透过率探讨134-136
3.2 HSA和定点修饰产物PEG-cys34HSA对脓毒症的药效学探讨136-139
4 讨论139-142
5 结论142-143
总结与展望143-145
1 本探讨的主要结论143-144
2 展望144-145
参考文献145-161
Article 1161-170
Artical 2170-178
致谢178-180
博士期间发表的论文及申请的专利180-181
学位论文评阅及答辩情况表181