探索不动鲍曼不动杆菌bla_(NDM-1)基因分子遗传学及表达与活性
最后更新时间：2024-02-23
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论文导读：内酰胺酶，由于首个病例在印度新德里发现，由此几点科学家把这种新发现的酶称为NDM-1(NewDelhimetallo-β-lactamase)。携带该基因的细菌几乎能对所有抗生素产生抗性，该酶水解活性远高于已发现的金属β-内酰胺酶，这一发现引发世人的关注。2010年中国首次报道了携带bla_(NDM-1)基因的阳性菌，该多重耐药鲍曼不动杆菌XM1570分离于
摘要：抗生素的出现和运用在动物与人类治疗疾病中发挥极为重要的意义，但是由于抗生素的大量滥用，导致了越来越多耐药菌株的出现，并且近几年出现很多新型的超级耐药细菌，增多了临床用药难度，严重危害动物和人类的健康。产生β-内酰胺酶是细菌耐药的重要机制之一，金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase, MBL）是β-内酰胺酶中的一类，其活性部位为一个或多个金属离子(主要为Zn~(2+))，其具有更高的水解抗生素活性。MBLs的底物包括除了单环从外的几乎所有β-内酰胺类抗生素，使细菌对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类等药物均有耐受性，而且临床上利用的β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等均不能抑制其活性，携带MBL基因的细菌对于公共卫生安全是一个很大的威胁。2008年，科学家报道一种新发现的由bla_(NDM-1)基因编码的金属-β-内酰胺酶，由于首个病例在印度新德里发现，由此几点科学家把这种新发现的酶称为NDM-1(New Delhimetallo-β-lactamase)。携带该基因的细菌几乎能对所有抗生素产生抗性，该酶水解活性远高于已发现的金属β-内酰胺酶，这一发现引发世人的关注。2010年中国首次报道了携带bla_(NDM-1)基因的阳性菌，该多重耐药鲍曼不动杆菌XM1570分离于一名肺癌病人的痰培养液中。本探讨从首次报道国内携带bla_(NDM-1)不动杆菌XM1570为基础，通过全基因组测序发现染色体基因组大小约为4.1Mb和质粒pXM1大小为47.3kb，bla_(NDM-1)基因位于质粒pXM1上，bla_(NDM-1)基因与已报道序列同源性为100%。通过对bla_(NDM-1)基因上下游序列分析发现，bla_(NDM-1)基因位于Tn125转座子上，转座子大小10099bp，两端为正向的ISAba125插入序列，包含8个阅读框。与已报道的不动杆菌属中携带bla_(NDM-1)基因的Tn125具有高度同源性。通过比较不同种属中bla_(NDM-1)基因上游序列发现，有着不同移动元件(IS26,IS903,IS5)从及截短的ISAba125，这些移动元件在介导不同种属间bla_(NDM-1)基因水平传播起到重要意义。序列比对发现ISAba125上下游碱基具有GTT重复碱基，与国内报道序列结果一致。在Tn5393d中，发现了位于与ISAba125两侧相同的连续序列，在分子遗传学上分析表明ISAba125整合子与Tn5393d有着一定的联系。国外报道的转座插入到染色体上的识别位点有所不同，但是一般为3个碱基，还不能确定是否有特异性的识别位点，但据此可从推测不动杆菌属中Tn125转座子在介导的bla_(NDM-1)基因的水平可能发挥了重要意义。本探讨对bla_(NDM-1)基因进行了克隆，应用生物信息学软件对NDM-1蛋白进行了初步的分析。NDM-1蛋白由270个氨基酸组成，分子质量为28487.86Da，等电点为5.89，SignalP4.1软件预测1-28位氨基酸为信号肽。BLAST比对发现NDM-1与其他亚型金属酶同源性很低，但是具有金属酶典型的活性中心。构建了两种表达载体： pET-28a::bla_(NDM-1)和pMAL-p2x::bla_(NDM-1)，诱导表达出了目的蛋白。BL21(pET-28a::bla_(NDM-1))表达蛋白从包涵体形式有着，而Tb1(pMAL-p2x::bla_(NDM-1))表达的重组蛋白主要有着于上清中。后续表达条件优化结果显示，在37℃、IPTG浓度为0.3mmol/l、诱导时间为8小时条件下，重组蛋白表达量最高，薄层扫描结果显示表达量占菌体蛋白的39.2%。采取亲和层析对目的蛋白进行了纯化。酶活性探讨和头孢显色法发现重组蛋白MBP-NDM-1具有金属酶活性，重组蛋白对亚胺培南的动力学试验结果为Km=69.347μM/l。EDTA作为一种金属螯合剂能够螯合NDM-1蛋白活性中心的Zn~(2+)，以而抑制其水解底物的活性。25μmol/L的EDTA可从抑制重组蛋白(1.068μg/mL)的酶活性。通过对所表达蛋白活性分析，为从后开发新型酶抑制剂探讨奠定了基础。关键词：鲍曼不动杆菌论文bla_(NDM-1)论文序列分析论文论文导读：及生物信息学分析34-461材料与办法34-382结果38-433讨论43-454小结45-46第三章NDM-1基因的表达及活性探讨46-661材料与办法46-542结果54-643讨论644小结64-66结论66-67参考文献67-71导师介绍71-72作者介绍72-73致谢73上一页12
表达论文酶活性论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可从关系人员哦。中文摘要4-6
Abstract6-12
前言12-14
第一篇 文献综述14-24
1 起源14-15
2 国内外流行近况15-17
3 NDM-1 的基因结构特征17-19
4 蛋白结构特征19-20
5 不同亚型的 NDM20-23
6 结语23-24
第二篇 探讨内容24-66
第一章 鲍曼不动杆菌 bla_(NDM-1)基因分子遗传学分析24-34
1 材料与办法24-25
2 结果与讨论25-33
3 小结33-34
第二章 bla_(NDM-1)基因克隆及生物信息学分析34-46
1 材料与办法34-38
2 结果38-43
3 讨论43-45
4 小结45-46
第三章 NDM-1 基因的表达及活性探讨46-66
1 材料与办法46-54
2 结果54-64
3 讨论64
4 小结64-66
结论66-67
参考文献67-71
导师介绍71-72
作者介绍72-73
致谢73
摘要：抗生素的出现和运用在动物与人类治疗疾病中发挥极为重要的意义，但是由于抗生素的大量滥用，导致了越来越多耐药菌株的出现，并且近几年出现很多新型的超级耐药细菌，增多了临床用药难度，严重危害动物和人类的健康。产生β-内酰胺酶是细菌耐药的重要机制之一，金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase, MBL）是β-内酰胺酶中的一类，其活性部位为一个或多个金属离子(主要为Zn~(2+))，其具有更高的水解抗生素活性。MBLs的底物包括除了单环从外的几乎所有β-内酰胺类抗生素，使细菌对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类等药物均有耐受性，而且临床上利用的β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等均不能抑制其活性，携带MBL基因的细菌对于公共卫生安全是一个很大的威胁。2008年，科学家报道一种新发现的由bla_(NDM-1)基因编码的金属-β-内酰胺酶，由于首个病例在印度新德里发现，由此几点科学家把这种新发现的酶称为NDM-1(New Delhimetallo-β-lactamase)。携带该基因的细菌几乎能对所有抗生素产生抗性，该酶水解活性远高于已发现的金属β-内酰胺酶，这一发现引发世人的关注。2010年中国首次报道了携带bla_(NDM-1)基因的阳性菌，该多重耐药鲍曼不动杆菌XM1570分离于一名肺癌病人的痰培养液中。本探讨从首次报道国内携带bla_(NDM-1)不动杆菌XM1570为基础，通过全基因组测序发现染色体基因组大小约为4.1Mb和质粒pXM1大小为47.3kb，bla_(NDM-1)基因位于质粒pXM1上，bla_(NDM-1)基因与已报道序列同源性为100%。通过对bla_(NDM-1)基因上下游序列分析发现，bla_(NDM-1)基因位于Tn125转座子上，转座子大小10099bp，两端为正向的ISAba125插入序列，包含8个阅读框。与已报道的不动杆菌属中携带bla_(NDM-1)基因的Tn125具有高度同源性。通过比较不同种属中bla_(NDM-1)基因上游序列发现，有着不同移动元件(IS26,IS903,IS5)从及截短的ISAba125，这些移动元件在介导不同种属间bla_(NDM-1)基因水平传播起到重要意义。序列比对发现ISAba125上下游碱基具有GTT重复碱基，与国内报道序列结果一致。在Tn5393d中，发现了位于与ISAba125两侧相同的连续序列，在分子遗传学上分析表明ISAba125整合子与Tn5393d有着一定的联系。国外报道的转座插入到染色体上的识别位点有所不同，但是一般为3个碱基，还不能确定是否有特异性的识别位点，但据此可从推测不动杆菌属中Tn125转座子在介导的bla_(NDM-1)基因的水平可能发挥了重要意义。本探讨对bla_(NDM-1)基因进行了克隆，应用生物信息学软件对NDM-1蛋白进行了初步的分析。NDM-1蛋白由270个氨基酸组成，分子质量为28487.86Da，等电点为5.89，SignalP4.1软件预测1-28位氨基酸为信号肽。BLAST比对发现NDM-1与其他亚型金属酶同源性很低，但是具有金属酶典型的活性中心。构建了两种表达载体： pET-28a::bla_(NDM-1)和pMAL-p2x::bla_(NDM-1)，诱导表达出了目的蛋白。BL21(pET-28a::bla_(NDM-1))表达蛋白从包涵体形式有着，而Tb1(pMAL-p2x::bla_(NDM-1))表达的重组蛋白主要有着于上清中。后续表达条件优化结果显示，在37℃、IPTG浓度为0.3mmol/l、诱导时间为8小时条件下，重组蛋白表达量最高，薄层扫描结果显示表达量占菌体蛋白的39.2%。采取亲和层析对目的蛋白进行了纯化。酶活性探讨和头孢显色法发现重组蛋白MBP-NDM-1具有金属酶活性，重组蛋白对亚胺培南的动力学试验结果为Km=69.347μM/l。EDTA作为一种金属螯合剂能够螯合NDM-1蛋白活性中心的Zn~(2+)，以而抑制其水解底物的活性。25μmol/L的EDTA可从抑制重组蛋白(1.068μg/mL)的酶活性。通过对所表达蛋白活性分析，为从后开发新型酶抑制剂探讨奠定了基础。关键词：鲍曼不动杆菌论文bla_(NDM-1)论文序列分析论文论文导读：及生物信息学分析34-461材料与办法34-382结果38-433讨论43-454小结45-46第三章NDM-1基因的表达及活性探讨46-661材料与办法46-542结果54-643讨论644小结64-66结论66-67参考文献67-71导师介绍71-72作者介绍72-73致谢73上一页12
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本论文由www.7ctime.com,需要论文可从关系人员哦。中文摘要4-6
Abstract6-12
前言12-14
第一篇 文献综述14-24
1 起源14-15
2 国内外流行近况15-17
3 NDM-1 的基因结构特征17-19
4 蛋白结构特征19-20
5 不同亚型的 NDM20-23
6 结语23-24
第二篇 探讨内容24-66
第一章 鲍曼不动杆菌 bla_(NDM-1)基因分子遗传学分析24-34
1 材料与办法24-25
2 结果与讨论25-33
3 小结33-34
第二章 bla_(NDM-1)基因克隆及生物信息学分析34-46
1 材料与办法34-38
2 结果38-43
3 讨论43-45
4 小结45-46
第三章 NDM-1 基因的表达及活性探讨46-66
1 材料与办法46-54
2 结果54-64
3 讨论64
4 小结64-66
结论66-67
参考文献67-71
导师介绍71-72
作者介绍72-73
致谢73