探讨诱导性慢病毒载体介导绿色荧光蛋白转基因标记与猪嵌合体制作网

论文导读：对这种近况,本次实验首先建立了慢病毒载体介导制作绿色荧光蛋白标记胚胎的技术系统,在此基础上探讨了不同发育阶段胚胎之间的嵌合发育规律,同时也初步探讨了部分猪iPS细胞系的嵌合发育能力,希望为今后该类探讨能够提供较为坚实的技术基础。实验结果如下1慢病毒介导的GFP转基因猪胚胎系统探讨(1)同时期胚胎注射不同滴度慢病毒
摘要：嵌合体是指将两种或多种具有不同遗传性状的胚胎或多能性细胞和早期胚胎聚合或经显微注射后所发育产生的一个个体。嵌合体是发育生物学探讨非常重要的技术手段,同时嵌合体发育,尤其是生殖系嵌合已经成为多能性干细胞(胚胎干细胞、诱导性多能干细胞)发育潜能的重要鉴定标准。哺乳动物中小鼠的嵌合体探讨是最广泛的,也是最深入的,但是其他物种方面的探讨则相对较少。猪是重要的畜牧生产物种,同时也是重要的人类医学模型,针对猪的多潜能干细胞探讨近些年也得到越来越多的重视。作为检验干细胞多能性重要标准之一的嵌合体发育在猪上也同样得到了大家的关注。尽管早期有些关于猪嵌合体探讨的报道,但是相对来说这些探讨还很不系统,对于猪胚胎发育的特殊规律重视还不够。针对这种近况,本次实验首先建立了慢病毒载体介导制作绿色荧光蛋白标记胚胎的技术系统,在此基础上探讨了不同发育阶段胚胎之间的嵌合发育规律,同时也初步探讨了部分猪iPS细胞系的嵌合发育能力,希望为今后该类探讨能够提供较为坚实的技术基础。实验结果如下1慢病毒介导的GFP转基因猪胚胎系统探讨(1)同时期胚胎注射不同滴度慢病毒,其中2×109I.U./ml的慢病毒感染猪胚胎组中,体外受精(In Vitro Fertipzation,IVF)和孤雌胚胎感染阳性率(80.00%、76.36%)和阳性囊胚率(90.74%、89.56%)都显著(P0.05)高于其它组,囊胚期的荧光强度也显著高于其他组,2×lO8I.U./ml滴度感染胚胎效率其次,2×107I.U./ml滴度的慢病毒感染效率最差。(2)同一滴度慢病毒感染不同时期胚胎,2×109I.U./ml的慢病毒感染猪2-cell胚胎组中,IVF和孤雌胚胎感染阳性率(80.00%、76.36%)和阳性囊胚率(90.74%、89.56%)都显著(P0.05)高于2×109I.U./ml的慢病毒感染猪1-cell胚胎组胚胎感染阳性率(60.07.00%、57.51%)和阳性囊胚率(79.17%、75.29%)；囊胚期的荧光强度也显著高于1-cell组；在2×108I.U./ml的慢病毒注射到两种胚胎后同样得到和上面陈述的一致的结果。(3)当慢病毒滴度是2×107I.U./ml或低于2×107I.U./ml时,即便在2-cell时期注射也几乎无法有效感染猪胚胎。另外,慢病毒感染的两种胚胎与对照组在卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数三个指标上没有显著差别(P0.05)。2不同发育时期胚胎聚合发育探讨(1)同步发育胚胎聚合后,在8-细胞胚胎之间的嵌合率(75.00%)高于4-细胞胚胎之间和2-细胞胚胎之间的嵌合率(65.00%、53.80%,P0.05)(2)非同步发育胚胎聚合后,2-细胞胚胎之间嵌合囊胚率和2-细胞卵裂球互换嵌合囊胚率(53.85%、62.50%)显著高于2-细胞胚胎与4-细胞胚胎的嵌合率(18.60%,P0.05)。3iPS嵌合胚胎的探讨(1)在2-cel1、4-cell和8-cell胚胎期注射具有绿色荧光标记的iPS细胞后培养1-2天后,绿色荧光消失,iPS无法嵌合到胚胎：在囊胚阶段注射,在体外培养1-2天后,部分ips细胞可以贡献到囊胚,形成嵌合胚胎。(2)几种iPS嵌合率的比较,68号、120号和122号iPS细胞嵌合率没有显著差别,实验组的平均囊胚细胞数多于对照组,说明一些iPS细胞已经嵌合到胚胎内。(3)胚胎移植后的结果浅析,共4株iPS细胞系作为供体细胞,体内和IVF胚胎作为受体,共移植19头猪,其中68号嵌合胚移植受体后发生妊娠,但大概40天左右时间流产,胎体被吸收,获得2个胎盘。(4)胎盘的鉴定和浅析,猪的胎盘为散布状,组织切片HE染色后观察到绒毛和绒毛毛细血管,PCR浅析初步鉴定结果为阳性。综上所述,2×109I.U./m1的慢病毒载体感染2-细胞期胚胎转基因效率最高,对猪胚胎发育没有显著影响。8-细胞胚胎间聚合后的嵌合发育率显著高于其他实验组；同步发育胚胎间的嵌合率高于非同步发育胚胎间的嵌合率。在桑葚胚前注射iPS无法形成嵌合胚胎,囊胚期注射iPS可以形成嵌合体,胚胎移植后获得流产胎盘,初步浅析表明iPS细胞参与胎盘发育。关键词：慢病毒载体论文绿色荧光蛋白论文聚合法论文嵌合发育论文诱导性多能干细胞论文
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Abstract10-12
1 前言12-19

1.1 嵌合体探讨简史12

1.2 猪的嵌合体探讨12

1.3 嵌合体的制作策略12-14

1.3.1 聚合法13

1.3.2 注射法13-14

1.4 嵌合体的鉴定14-15

1.4.1 色素浅析14

1.4.2 同功酶法14

1.4.3 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)14
1.4.4 可变数目串联重复(variable number tandem re-peats,VNTR)14
1.4.5 短串联重复序列(short tandem repeats,STR)14-15

1.4.6 单核苷酸多态性15

1.4.7 实时荧光定量PCR技术15

1.5 嵌合体技术运用前景15-16

1.5.1 发育生物学领域15-16

1.5.2 医学领域16

1.6 诱导性多潜能干细胞探讨进展16-17

1.6.1 猪iPS嵌合探讨进展17

1.6.2 iPS细胞运用前景17

1.7 慢病毒载体法的进展17-18

1.7.1 慢病毒载体特点17-18

1.7.2 慢病毒制备转基因动物探讨概述18

1.8 探讨的目的和作用18-19

2 材料与策略19-25

2.1 实验材料19-20

2.

1.1 猪卵巢19

2.

1.2 主要试剂19

2.

1.3 主要器材19

2.

1.4 iPS供核细胞19-20

2.

1.5 实验动物20

2.

1.6 卵母细胞及胚胎培养相关试剂20

2.2 实验策略20-25

2.1 卵母细胞成熟培养20-21

2.2 慢病毒的稀释与保存21

2.3 精子的采集和保存21

2.4 卵母细胞体外受精(IVF)21

2.5 慢病毒注射21

2.6 凹窝聚合21

2.7 胚胎染色和囊胚细胞计数21-22

2.8 嵌合胚胎的鉴定22

2.9 注射用的细胞准备22

2.

1.10 猪的发情观察和受体移植22

2.2.11 组织切片HE染色22-23

2.12 基因组DNA提取23-24

2.13 统计浅析24-25

3 结果与浅析25-37

3.1 慢病毒感染制备转基因胚胎25-28

3.

1.1 慢病毒感染1-细胞期胚胎25-26

3.

1.2 慢病毒感染2-细胞期胚胎26-28

3.2 同时期聚合胚胎的探讨28-29

3.3 iPS细胞嵌合不同时期胚胎能力的探讨29-31

3.4 两株iPS细胞的嵌合能力的比较31-32

3.5 iPS细胞嵌合胚胎受体猪移植32-37

3.

5.1 流产胎儿后的胎盘浅析34-37

4 讨论37-40

4.1 慢病毒感染猪胚胎的探讨37

4.2 聚合法探讨不同时期胚胎的嵌合率37-38

4.3 iPS嵌合胚胎的探讨38-40

4.

3.1 前期卵裂球时期胚胎无法嵌合的理由38-39

4.

3.2 iPS嵌合囊胚的位置39

4.

3.3 造成妊娠率的低可能有以下理由39-40

5 结论40-41
致谢41-42
参考文献42-46
附录46-48
攻读硕士学位期间发表的学术论文48