试议高效生物素高产菌筛选与育种

论文导读：生菌的紫外线-氯化锂复合诱变和高效液相色谱法检测生物素产量56-674.1前言564.2实验材料与策略56-604.

2.1材料56-574.2仪器574.3药品12下一页

摘要：生物素是一种不能由人体合成的水溶性维生素，其参与体内重要的蛋白质和脂肪酸代谢。由于其重要的生物学作用，被广泛地运用到多个领域。本论文对生物素高产菌株的筛选和育种进行了探讨，探讨内容主要包括生长圈法筛选生物素产生菌株、生物素产生菌株的分类鉴定、生物素产生菌株的紫外线-氯化锂复合诱变、高效液相色谱法检测生物素产量和生物素高产基因工程菌的构建。实验利用产氨短杆菌的营养需求，通过平板初筛和摇瓶复筛，获得两株产生物素能力较强且稳定的菌株，其中一株菌FD的生物素产量达到191.6μg/L。为了更好地了解菌株的功能和特性，对两株产量较高的菌株FD和DJ①，通过菌株形态、生理生化特性以及菌株的16S rRNA基因序列浅析对其进行分类鉴定，将它们鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.。采取紫外线-氯化锂复合诱变，通过生物素类似物的抗性筛选，获得菌株FD的一株突变菌，生物素产量为207μg/L。实验采取高效液相色谱法检测发酵液中生物素的含量，其线性回归方程为Y=9566.99695X-20893.30388，R2=0.9992，在15~200μg/mL的范围内，其吸收峰面积y与生物素浓度x之间有着着良好的线性联系。实验构建了一个重组表达载体pBBR1MCS-5bioB，将该表达载体利用三亲接合转移法转化到生物素产生菌假单胞菌FD中，构建了工程菌。通过对该工程菌进行转录水平上的检测表明，重组表达载体pBBR1MCS-5bioB在工程菌中转录成功，最后用高效液相色谱法检测高产工程菌的生物素产量。工程菌的生物素产量为929.24μg/L，比未重组假单胞菌FD产量提升了3.85倍。关键词：生物素论文筛选论文分类鉴定论文育种论文高效液相色谱论文基因克隆与表达论文
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ABSTRACT6-12
第一章 文献综述12-24

1.1 生物素的介绍12-13

1.2 生物素的运用13-14

1.2.1 在动物生产中的运用13

1.2.2 在医药上的运用13-14

1.2.3 在核酸探针标记中的作用14

1.2.4 在发酵工业中的运用14

1.3 生物素生物合成14-20

1.3.1 生物素生物合成途径及相关基因15-17

1.3.2 生物素生物合成操纵子的调节机制17-18

1.3.3 生物素高产菌育种18-20

1.4 生物素的检测20-22

1.4.1 微生物法20

1.4.2 生物法20

1.4.3 高效液相色谱法20-21

1.4.4 酶联免疫法21

1.4.5 其他策略21-22

参考文献22-24
第二章 土壤中生物素产生菌的筛选与分离24-33

2.1 前言24

2.2 材料与策略24-28

2.1 菌种来源24-25

2.2 培养基及培养条件25-26

2.3 实验策略26-28

2.3 结果与浅析28-31

2.3.1 土壤中生物素产生菌的初筛28-29

2.3.2 生物素产生菌的复筛29-31

2.4 本章小结31-32

参考文献32-33
第三章 生物素产生菌的分类鉴定33-56

3.1 前言33

3.2 材料与策略33-45

3.

2.1 供试菌株33

3.

2.2 主要仪器33-34

3.

2.3 主要药品与试剂34-36

3.

2.4 实验策略36-45

3.3 实验结果与浅析45-54

3.1 菌落形态观察和革兰氏染色45

3.2 生理生化特性45-47

3.3 基因组DNA的提取47-48

3.4 16S rRNA基因的PCR扩增结果48-49

3.5 16S rRNA基因的PCR扩增条带纯化49

3.6 鉴定携带16S rRNA基因的质粒的克隆49-50

3.3.7 菌株FD16S rRNA基因的测序结果、序列比对及系统进化树的构建50-52
3.3.8 菌株DJ①16S rRNA基因的测序结果、序列比对及系统进化树的构建52-54

3.4 本章小结54-55

参考文献55-56
第四章 生物素产生菌的紫外线-氯化锂复合诱变和高效液相色谱法检测生物素产量56-67

4.1 前言56

4.2 实验材料与策略56-60

4.

2.1 材料56-57

4.

2.2 仪器57

4.

2.3 药品论文导读：论文目录89上一页12

与试剂57

4.

2.4 实验策略57-60

3 实验结果与浅析60-65 4.

3.1 紫外诱变60-62

4.

3.2 菌种复壮62-63

4.

3.3 高效液相色谱法检测发酵液生物素产量63-65

4.4 本章小结65-66
参考文献66-67
第五章 生物素高产工程菌的构建67-87

5.1 前言67

5.2 材料与策略67-78

5.

2.1 供试菌株67-68

5.

2.2 主要仪器68

5.

2.3 主要药品与试剂68-70

5.

2.4 实验策略70-78

5.3 实验结果与浅析78-85
5.3.1 恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida KT2440 bioB 基因的扩增78-79
5.

3.2 pMD 19-T-bioB质粒的提取和质粒PCR验证79

5.

3.4 bioB基因的测序79-80

5.

3.5 重组表达载体pBBR1MCS-5bioB的双酶切验证80-81

5.

3.6 生物素高产工程菌的构建81-82

5.

3.7 工程菌中表达载体pBBR1MCS-5bioB的验证82-83

5.

3.8 转录水平检测 bioB 基因的表达83

5.

3.9 重组质粒稳定性83

5.

3.10 高效液相色谱法检测基因重组菌生物素产量83-85

5.4 本章小结85
参考文献85-87
第六章 总结与展望87-88
致谢88-89
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