分析鞭毛Vibrioalginolyticus鞭毛马达定子蛋白PomB及H环组成蛋白FlgT结构和功能

论文导读：
摘要：Na+驱动的细菌鞭毛马达，是由钠离子横跨细胞膜而引起的电化学势能为能量驱动的。鞭毛马达包括转子和定子两部分，它们都是由若干蛋白组成的。定子蛋白PomA、PomB和T环组成蛋白MotX、MotY被认为是鞭毛马达最关键的组成蛋白，且是产生旋转力矩所必须的蛋白。Vibrio alginolyticus是单极生鞭毛菌株，能够在液体中游动和在粘性的液体表面泳动，是探讨Na+驱动鞭毛马达的最佳选择。在Vibrio alginolyticus极生鞭毛马达中，PomA和PomB形成定子复合体，同时伴随着Na+流过该复合体而产生旋转力矩。定子复合体装配到转子周围适当的位置，是通过预测的PomB (PomBC)周质区域的肽聚糖层结合结构域来实现的。为了探讨定子复合体中离子渠道的特点和功能，以及定子装配在转子周围形成完整的动力马达的机理，人们探讨了许多这些蛋白突变体的结构和功能。本论文中，我们通过构建了一系列的删除菌株及点突变菌株，来探讨PomB周质区域蛋白的结构和功能，及FlgT每一个结构域对鞭毛环状基体结构形成的影响。针对PomB跨膜螺旋和肽聚糖层结合结构域间的连接区域，我们构建了一系列N末端删除突变体和连接区域删除突变体。其中，包含以135位氨基酸到315位氨基酸的PomBC5突变体，能够形成稳定的同源二聚体。当该突变体在野生型寄主菌株（VIO5）中过量表达时，它能显著地抑制野生型菌株的运动能力。另一方面，删除了连接区域80个氨基酸的突变体(PomBΔL)，仍然能够维持运动的功能。但是，当PomBΔL和PomA一起过量表达于原始菌株NMB191时，它们能够抑制原始菌株的生长。而这种对原始菌株生长的抑制，能够被PomB蛋白跨膜螺旋区域关键氨基酸Asp的突变D24N所消除。这些探讨结果表明，大量Na+流过发生突变的定子复合体而导致原始菌株生长的抑制。在预测的PomB周质区域，同源二聚体界面螺旋位置上的氨基酸发生突变，仍然形成二聚体结构，说明虽然PomB/MotB定子蛋白基本的结构是相同的，但PomB有着自己独特的蛋白构型。PomBΔLL168P突变体位于预测PomB周质区域N端螺旋上，该位点的突变显著提升了原始菌株中具有运动能力菌株的数目，但该突变体仍然会抑制原始菌株的生长。这表明，PomB周质区域N端螺旋蛋白结构的变化将会影响定子的装配效率。我们的探讨结果还表明，PomB周质连接区域蛋白结构，对调节Na+流过定子复合体的离子渠道，以及鞭毛马达的运动能力都有着非常重要的影响。与PomA/PomB定子复合体相比较，GFP融合的PomA/PomBΔL突变体降低了其定子的极点定位，更确切的说明了该PomB周质连接区域，对定子正确的装配到转子的周围，起着重要的调节作用。关键词：Vibrio论文alginolyticus论文单极生鞭毛马达论文PomB论文蛋白论文GFP论文
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ABSTRACT6-10
第一章 文献综述10-28
1.1 Vibrio alginolyticus 的 Na~+驱动极生鞭毛的基本结构12-15
1.2 Vibrio alginolyticus Na~+驱动鞭毛的极点定位15-17

1.3 Na~+驱动定子复合体的组成和结构17-20

1.4 Na~+流过 PomA/PomB 定子复合体路径20-23

1.5 定子复合体装配进鞭毛马达的动力学历程23-25

1.6 Na+驱动鞭毛马达的旋转特性25-27

1.7 本课题探讨的作用、主要内容和革新点27-28

1.7.1 本课题探讨的作用27

1.7.2 本课题探讨的主要内容27

1.7.3 本课题探讨的革新点27-28

第二章 Vibrio alginolyticus Na~+驱动鞭毛定子蛋白 PomB 周质区域蛋白结构和功能特性28-53

2.1 引言28-31

2.2 材料和策略31-35

2.1 菌株、质粒和突变31-32

2.2 菌株的培养及运动能力的测量32-33

2.3 生长曲线的测定33

2.4 全细胞蛋白的制备及周质蛋白的制备33

2.5 蛋白的检测33-34

2论文导读：浅析性体积排阻色谱342.2.8利用莹光显微镜观察定子的极点定位34-352.3结果35-492.3.1PomB周质区域的蛋白形成同源二聚体35-362.3.2过量表达PomBC蛋白对弧菌运动能力的影响36-392.3.3‘Linker’区域删除菌株（PomBΔL）功能的探讨39-412.3.4过量表达PomBΔL片段蛋白对寄主菌生长的影响41-442.3.5PomBΔL(Δ41-120)N
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2.6 PomB 片段的纯化34

2.7 浅析性体积排阻色谱34

2.8 利用莹光显微镜观察定子的极点定位34-35

2.3 结果35-49

2.3.1 PomB 周质区域的蛋白形成同源二聚体35-36

2.3.2 过量表达 PomBC蛋白对弧菌运动能力的影响36-39

2.3.3 ‘Linker’区域删除菌株（PomBΔL）功能的探讨39-41

2.3.4 过量表达 PomBΔL片段蛋白对寄主菌生长的影响41-44

2.3.5 PomBΔL(Δ41-120) N 端螺旋上的突变对菌株运动能力的影响44-47

2.3.6 PomBΔL及其突变体对定子转配到转子周围的影响47-49

2.4 讨论49-53

第三章 结论与展望53-54
参考文献54-62
附录62-69
致谢69-70
作者介绍70