试议拟南芥拟南芥蓝光受体与SPA1蛋白相互作用和功能生化

论文导读：A1蛋白是通过WD-40结构域与CRY1蛋白相互作用。对CRY1蛋白与SPA1蛋白蓝光依赖的相互作用后如何调节植物的蓝光响应的进一步探讨发现：在黑暗条件下SPA1蛋白与COP1蛋白间相互作用能够推动COP1蛋白的活力，在蓝光下CRY1蛋白能与SPA1蛋白蓝光依赖的相互作用，竞争了SPA1-COP1蛋白复合体中的SPA1蛋白，以而抑制了COP1在蓝光下的活性。
摘要：在大多数生物中，蓝光受体隐花色素在蓝光的介导下能制约多种基因的表达，以而制约植物光相关生长发育。但隐花色素信号传导的分子机制仍不清楚，有探讨推测，在蓝光下隐花色素能够通过抑制E3泛素连接酶CONSTITUTIVEPHOTOMORPHOGENIC1(COP1)的功能来调节基因的表达，但是植物隐花色素调节COP1功能的机制仍旧未知。本探讨证明了拟南芥隐花色素1（CRY1）或隐花色素2（CRY2）能够蓝光依赖的与COP1互作蛋白SUPPRESSOR OFPHYTOCHROME A1(SPA1)相互作用，并通过SPA1调控COP1-SPA1蛋白复合体的活性。CRY2蛋白与SPA1蛋白的相互作用探讨：通过生物信息学浅析CRY2蛋白与SPA1蛋白的结构域，发现CRY2蛋白有两个主要的结构域，N端的类光裂解酶结构域（PHR）和C端的隐花色素C结构域（CCR）。PHR结构域在进化上非常保守，并且为隐花色素2的发色团绑定结构域，而CCR结构域是隐花色素的功能结构域。SPA1蛋白是主要由三个结构域构成：N端的类激酶结构域、中间的螺旋结构域与C端的WD重复结构域。通过酵母双杂交以及免疫共沉淀等实验证明了CRY2蛋白的PHR结构域能与SPA1的类激酶结构域蓝光依赖的相互作用，并且这两个结构域是CRY2蛋白与SPA1蛋白相互作用的必要结构域,在实验中并发现CRY2蛋白与SPA1蛋白之间的相互作用能影响CRY2的功能。由于CRY2蛋白能与SPA1蛋白蓝光依赖的相互作用，故而SPA1蛋白能通过介导CRY2蛋白来调节植物开花，并发现SPA1蛋白与COP1蛋白相互作用能激活COP1蛋白的活性， CRY2蛋白与COP蛋白相互作用却抑制了COP1蛋白的活性，推测蓝光可能影响CRY2蛋白、SPA1蛋白和COP1三个蛋白质的相互作用。通过分子遗传实验证明了SPA1蛋白在CRY2蛋白调控的蓝光信号传导途径中位于CRY2蛋白的下游，并通过CRY2蛋白来影响COP1蛋白降解CO蛋白。实验结果说明了CRY2蛋白与SPA1蛋白蓝光依赖的相互作用能推动CRY2蛋白与COP1蛋白的相互作用。CRY1蛋白与SPA1蛋白相互作用探讨：为了解CRY1蛋白与SPA1蛋白的相互作用，同样首先浅析了CRY1蛋白与SPA1蛋白互作的必要结构域。CRY1蛋白与CRY2蛋白结构类似，有两个主要的结构域：N端的内光裂解酶结构域（PHR）和C端的隐花色素C结构域（CCR）。CRY1蛋白的PHR结构域在进化历程中也是非常保守的。而CCR结构域是CRY1蛋白的重要的功能结构域。在探讨中发现，与CRY2蛋白不同的是，CRY1蛋白的CCR结构域是CRY1蛋白与SPA1蛋白相互作用的必要结构域，而SPA1蛋白是通过WD-40结构域与CRY1蛋白相互作用。对CRY1蛋白与SPA1蛋白蓝光依赖的相互作用后如何调节植物的蓝光响应的进一步探讨发现：在黑暗条件下SPA1蛋白与COP1蛋白间相互作用能够推动COP1蛋白的活力，在蓝光下CRY1蛋白能与SPA1蛋白蓝光依赖的相互作用，竞争了SPA1-COP1蛋白复合体中的SPA1蛋白，以而抑制了COP1在蓝光下的活性。表明了CRY1蛋白与SPA1蛋白的相互作用通过抑制SPA1蛋白与COP1蛋白相互作用而阻碍HY5蛋白被COP1蛋白泛素化，以而使HY5蛋白在蓝光下不被降解。本论文揭示了植物蓝光受体CRY1和CRY2在光下调节HY5蛋白或CO蛋白的降解，以调节植物生长发育的新调控机制。探讨结果阐述了植物蓝光受体能够在蓝光下与COP1蛋白的相互作用或影响SPA1蛋白与COP1蛋白之间的相互作用的强度，在以前对植物蓝光受体的探讨中并未发现光响应的互作机制，本探讨证明了植物蓝光受体有着与其他蛋白光响应的相互作用而调节植物的生长发育。关键词：拟南芥论文隐花素1论文隐花素2论文组成型光形态建成1论文酵母双杂交论文免疫共沉淀论文
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Abstract6-8
英文缩写词8-9
目录9-12
第一章 绪论12-32

1.1 隐花色素的介绍12

1.2 隐花色素的历史背景12-13

1.3论文导读：与策略53-544.1.1实验材料53-544.1.1.1酵母菌株534.1.1.2酵母双杂交载体534.1.1.3植物材料53-544.1.2实验策略544.1.2.1拟南芥的种植544.1.2.2农杆菌转化544.1.2.3拟南芥的转化544.2结果与讨论54-684.2.1拟南芥SPA1蛋白与CRY2相互作用的结构域54-614.2.2拟南芥SPA1蛋白与CRY1相互作用的结构域61-634.2.3
隐花色素的功能13-21

1.3.1 隐花色素的表达与亚细胞定位13-14

1.3.2 去黄化的光照刺激14-16

1.3.2.1 下胚轴伸长的蓝光抑制14-15

1.3.2.2 蓝光刺激子叶伸长15

1.3.2.3 蓝光促使叶绿体发育15-16

1.3.3 开花时间的光周期调节16-17

1.3.4 光调节植物生物钟17-18

1.3.5 光照刺激对于保卫细胞的发育与叶片气孔开度的影响18

1.3.6 根发育的光照调节18-19

1.3.7 其他功能19-21

1.3.7.1 磁场感应19

1.3.7.2 细胞程序性死亡（PCD）19-20

1.3.7.3 向光性20

1.3.7.4 向地性20-21

1.3.7.5 有没有不依赖 CRY 的蓝光响应21

1.4 隐花色素的结构21-25

1.4.1 PHR 结构域22-23

1.4.2 CCR23-24

1.4.3 光诱导性构象变化24-25

1.5 隐花色素光生物化学25-26

1.5.1 蓝光依赖的隐花色素磷酸化25-26

1.5.2 蓝光响应的 CRY2 蛋白降解26

1.6 CRY 相互作用蛋白与隐花色素的信号传导26-32

1.6.1 光敏色素27-28

1.6.2 含有 LOV 结构域的 F-box 蛋白 ZTL28

1.6.3 E3 连接酶 COP128-29

1.6.4 CRY 相互作用 bHLH 蛋白29-31

1.6.5 植物蓝光受体互作蛋白的筛选31-32

第二章 植物蓝光受体 CRY2 与 SPA1 蛋白蓝光依赖的相互作用32-47

2.1 材料与策略32-36

2.

1.1 实验材料32-33

2.

1.1 酵母菌株32

2.

1.2 酵母双杂交载体32

2.

1.3 光源32-33

2.

1.4 主要试剂及培养基配置33

2.

1.2 实验策略33-36

2.

1.2.1 RNA 的提取33

2.

1.2.2 PCR 扩增目的片段或启动子33-34

2.

1.2.3 酵母双杂交载体构建及转化34-35

2.

1.2.4 DNA 目的片段与载体连接反应35

2.

1.2.5 转化 DH5α大肠杆菌感受态35

2.

1.2.6 酵母双杂交载体转化35-36

2.

1.2.7 β-半乳糖苷酶活性检测36

2.2 结果与讨论36-47
2.2.1 拟南芥 SPA1 蛋白与 CRY2 蛋白在酵母细胞中蓝关依赖的相互作用36-42
2.2.2 拟南芥 SPA1 蛋白与 CRY2 在植物细胞中蓝光依赖的相互作用42-44
2.2.3 拟南芥 SPA1 蛋白与 CRY2 蛋白在蓝光下共定位于植物细胞中44-45

2.4 蓝光或红光光源纯度的测定45-47

第三章 植物蓝光受体 CRY1 与 SPA1 蛋白蓝光依赖的相互作用47-53

3.1 材料与策略47

3.

1.1 实验材料47

3.

1.2 实验策略47

3.2 结果与讨论47-53
3.2.1 拟南芥 SPA1 蛋白与 CRY1 在酵母细胞中蓝关依赖的相互作用47-50
3.2.2 拟南芥 SPA1 蛋白与 CRY1 在植物细胞中蓝光依赖的相互作用50-51
3.2.3 拟南芥 SPA1 蛋白与 CRY2 蛋白在蓝光下共定位于植物细胞中51-53
第四章 植物蓝光受体 CRY

1、CRY2 与 SPA1 蛋白相互作用的结构域53-68

4.1 材料与策略53-54

4.

1.1 实验材料53-54

4.

1.1 酵母菌株53

4.

1.2 酵母双杂交载体53

4.

1.3 植物材料53-54

4.

1.2 实验策略54

4.

1.2.1 拟南芥的种植54

4.

1.2.2 农杆菌转化54

4.

1.2.3 拟南芥的转化54

4.2 结果与讨论54-68
4.

2.1 拟南芥 SPA1 蛋白与 CRY2 相互作用的结构域54-61

4.

2.2 拟南芥 SPA1 蛋白与 CRY1 相互作用的结构域61-63

4.2.3 拟南芥 CRY1 蛋白与 CRY2 蛋白通过不同的结构域与 SPA1 相互作用63-68
第五章 SPA1 蛋白在蓝光信号传导途径中的作用68-82

5.1 材料与策略68-70

5.

1.1 实验材料68-69

5.

1.1 植物材料68

5.

1.2 主要试剂68-69

5.

1.2 实验策略69-70

5.

1.2.1 RNA 的提取69

5.

1.2.2 酵母转化69

5.

1.2.3 荧光实时定量 PCR(Q-PCR)69-70

5.2 结果与讨论70-82
5.2.1论文导读：2SPA1蛋白与CRY2蛋白调节CO蛋白降解71-735.2.3SPA1蛋白与CRY2蛋白调节FT基因的表达73-745.2.4SPA1蛋白参与CRY1蛋白调节植物下胚轴的伸长74-755.2.5SPA1蛋白与CRY2蛋白调节HY5蛋白降解75-775.2.6SPA1蛋白与CRY2蛋白调节CHS基因的表达77-785.2.7SPA4蛋白与CRY1蛋白蓝光依赖的相互作用78-82第
SPA1 蛋白参与 CRY2 蛋白调节植物开花70-71
5.

2.2 SPA1 蛋白与 CRY2 蛋白调节 CO 蛋白降解71-73

5.

2.3 SPA1 蛋白与 CRY2 蛋白调节 FT 基因的表达73-74

5.

2.4 SPA1 蛋白参与 CRY1 蛋白调节植物下胚轴的伸长74-75

5.

2.5 SPA1 蛋白与 CRY2 蛋白调节 HY5 蛋白降解75-77

5.

2.6 SPA1 蛋白与 CRY2 蛋白调节 CHS 基因的表达77-78

5.

2.7 SPA4 蛋白与 CRY1 蛋白蓝光依赖的相互作用78-82

第六章 蓝光受体 CRY

1、CRY2 调节 SPA1-COP1 蛋白复合体的分子机制82-96

6.1 材料与策略82-83

6.

1.1 实验材料及主要试剂82

6.

1.2 主要试剂82

6.

1.3 实验策略82-83

6.

1.3.1 酵母三杂交实验82

6.

1.3.2 其他实验策略82-83

6.2 结果与讨论83-96
6.2.1 蓝光下 CRY1 蛋白在酵母细胞中抑制 SPA1-COP1 蛋白复合体的功能83-86
6.2.2 蓝光下 CRY1 蛋白在植物细胞中抑制 SPA1-COP1 蛋白复合体的功能86-88
6.2.3 蓝光下 CRY2 蛋白在酵母细胞中抑制 SPA1-COP1 蛋白复合体的功能88-91
6.2.4 蓝光下 CRY2 蛋白在植物细胞中抑制 SPA1-COP1 蛋白复合体的功能91-93
6.2.6 蓝光下 CRY

1、CRY2 蛋白抑制 SPA1-COP1 蛋白复合体不同的分子机制93-96

结论96-98
参考文献98-123
附录 A 攻读学位期间所发表和完成的学术论文目录123-124
致谢124