简述磷酸化Grb7蛋白SH2结构域结合新型非磷酸化模序

论文导读：NA文库克隆测序53-545非磷酸化肽段测序54-626免疫共沉淀和WESTERNBLOT结果原图62-647构建与MRLUC融合的ERBB3CDNA质粒测序结果64-678EXPASY网站上列出的蛋白Q9NPP6的相互作用方式图及与GRB7蛋白相互作用蛋白67-689BRET实验原始数据68-73表9.1BRET原始数据

(一)68-71表9.2BRET原始数据(二)71-73综述GRB7蛋白的探讨进

摘要：Grb7蛋白是一种接头蛋白,该蛋白是Grb7蛋白家族的成员之一,这个蛋白家族包括Grb7, Grb10和Grb14三个成员。现在探讨发现,Grb7蛋白在一些恶性肿瘤组织中,尤其是高转移性肿瘤组织中处于高表达状态,比如乳腺癌,食管癌,胃癌等。编码Grb7蛋白的基因位于人染色体17q12-q21,该区域在临床检验中已被证实在某些肿瘤中有显著的扩增,这一基因基础,决定了Grb7蛋白有可能成为临床治疗肿瘤的一个重要靶点。在Grb7蛋白中,一共有三个主要的功能区域,N末端富含脯氨酸,中间序列和Caenorhabditis elegans的Mig-10蛋白有很高的相似性,该结构域在细胞迁移中发挥了重要作用,C末端是一个SH2结构域。SH2结构域在Grb7蛋白参与的细胞信号传导通路中发挥了重要作用。虽然Grb7蛋白SH2结构域主要是以结合磷酸化酪氨酸模序为主,但近年来的探讨发现Grb7蛋白SH2结构域也可以结合非磷酸化模序,而且由于非磷酸化肽段较磷酸化肽段在体内更加易稳定有着,所以探讨Grb7蛋白SH2结构域结合非磷酸化肽段的特性更有助于研制针对Grb7蛋白高表达的肿瘤治疗的药物。在本论文的探讨中,我们利用酵母双杂交的策略,在随机多肽文库中筛选到了可结合Grb7蛋白SH2结构域的一系列非磷酸化肽段,这些肽段的共同之处在于,每个肽段序列中均含一个22个氨基酸序列,该序列N末端为GIPT/N/K的保守序列,C末端为G/WD/IP的保守序列,中间为15个随机排列的氨基酸,富含丝氨酸,苏氨酸和脯氨酸,突变实验表明22个氨基酸序列中,两端保守的7个氨基酸对非磷酸化肽段结合Grb7蛋白SH2结构域发挥重要作用,这种新的结合形式在体外免疫共沉淀和活细胞内的荧光能量转移实验已得到证实。关键词：SH2结构域论文Grb7蛋白论文非磷酸化肽段论文随机多肽文库论文
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Abstract7-8
前言8-10
技术路线10-11
材料与策略11-34
1 材料11-19

1.1 酵母双杂交系统材料11-17

1.2 细胞学实验材料17-19

2 实验策略19-34

2.1 诱饵蛋白(BAIT)构建19-20

2.2 以琼脂糖凝胶中回收DN段(博大泰克试剂盒法)20

2.3 PCR产物的回收(天根试剂盒法)20

2.4 目的片段及载体DNA的酶切20-21

2.5 以琼脂糖凝胶中回收DN段(博大泰克试剂盒法)21

2.6 酶切产物的纯化(天根试剂盒法)21

2.7 纯化的酶切产物和酶切载体进行连接21-22

2.8 化学感受态细胞的制备22

2.9 连接产物转化化学感受态细胞22

2.10 质粒DNA的小量制备22

2.11 重组质粒的PCR及酶切鉴定22-23

2.12 DN段的序列浅析23

2.13 酵母双杂交筛选随机多肽文库23-24

2.14 诱饵蛋白筛选非磷酸化随机多肽文库(顺序转化法)24-25

2.15 阳性克隆DNA序列的获得25-26

2.16 酵母双杂交筛选CDNA文库26

2.17 关键位点突变实验26-27

2.18 细胞学实验27-30

2.19 细胞裂解30

2.20 免疫共沉淀30-31

2.21 蛋白电泳31-32

2.22 蛋白质以SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜(湿式转膜)32

2.23 杂交与显色32-33

2.24 肽段体外干扰实验33

2.25 荧光能量转移实验33-34

结果34-42
1 随机多肽文库筛选到结合GRB7 SH2结构域的非磷酸化肽段34-36
2 人骨髓CDNA文库筛选到结合GRB7 SH2结构域的序列36-37
3 结合GRB7 SH2结构域时,22个氨基酸模序中两端保守序列起重要作用37
4 免疫共沉淀实验证实非磷酸化肽段41结合GRB7 SH2结构域37-38
5 BRET检测到非磷酸化肽段10,41结合GRB7 SH2结构域38-40
6 非磷酸化配体41-A与磷酸化配体可干扰GRB7 SH2结构域结合肽段4140-42
讨论42-44
结论44-45
参考文献45-49
附录49-73
1 酵母双杂交结果49-52
2 MRLUC测序结果52-53
3 EYFP测序结果53
4 GRB7 SH2结构域筛选到的人骨髓CDNA文库克隆测序53-54
5 非磷酸化肽段测序54-62
6 免疫共沉淀和WESTERN BLOT结果原图62-64
7 构建与MRLUC融合的ERBB3 CDNA质粒测序结果64-67
8 EXPASY网站上列出的蛋白Q9NPP6的相互作用方式图及与GRB7蛋白相互作用蛋白67-68
9 BRET实验原始数据68-73
表9.1 BRET原始数据

(一)68-71

表9.2 BRET原始数据

(二)71-73

综述 GRB7蛋白的探讨进展73-95
参考文献86-95
个人简历95-96
在读期间待(已)发表文章96-97
致谢97-99