简谈弧菌致病微生物铁代谢相关蛋白ViuP、FepB结构与功能

论文导读：
摘要：作为地球上分布最广的金属元素,铁在自然界中的含量可以说是相当丰富,但是大部分铁都是以难溶的氧化态有着,这种状态的铁元素难以被微生物利用。而且过量的铁对生物体还有潜在的危害性,在富氧条件下,细胞内的呼吸作用会产生一些过氧化物和H2O2,亚铁离子能够与过氧化氢通过Fenton反应产生对生物体有害的氢氧根自由基,氢氧根自由基能够通过氧化反应破坏诸如蛋白质、核酸、脂肪等生物大分子。由此,生物体需要精确制约体内游离铁的含量,在宿主体内,冗余的铁元素被转铁蛋白、乳铁蛋白等铁蛋白螯合掉,能供微生物利用的铁元素少之又少。而铁对于微生物的生长繁殖又是必需的,为了获得铁元素,一些细菌和真菌类能够合成一种能够高效螯合铁离子的小分子化合物-铁载体,来获得所需要的铁元素。以与铁配位的亚体的角度来看,铁载体可以分成四大类：儿茶酚型铁载体、羟基氧肟酸型铁载体、羧酸类铁载体,还有一类是前面三类的混合型铁载体。这些种类的铁载体中,儿茶酚型铁载体对铁的亲和力最高,这种铁载体大部分是通过2,3-二羟基苯甲酸亚体上的氧原子与铁进行六配位,其复合物体现出三个单位的负电荷。目前为止发现的对铁亲和力最高的儿茶酚型铁载体-肠菌素与铁作用,其解离常数可达10-52。儿茶酚型铁载体的另一个代表成员是由霍乱弧菌合成的弧菌素分子,它的分子骨架由反亚精胺、苏氨酸和2,3-二羟基苯甲酸三部分构成。微生物进入宿主中之后,会通过合成铁载体的方式来获得铁元素,为了应对微生物的这种入侵,阻止微生物获得所需要的铁元素,哺乳动物能够合成一种叫siderocapn的免疫蛋白,这种免疫蛋白后来证实它能够高效地捕获儿茶酚型铁载体-肠菌素,Raymond等人通过用肠菌素对siderocapn荧光淬灭的实验得出siderocapn蛋白对肠菌素的亲和力相当高,解离常数可以达到纳摩尔的级别。由此,肠菌素分子虽然对铁的螯合性非常强,但在siderocapn免疫蛋白的作用下,螯合了铁离子的肠菌素分子并不能被大肠杆菌收回运送到细胞内供其利用,以而在这个历程中siderocapn蛋白起到了免疫杀菌的作用。为了逃避宿主siderocapn蛋白的免疫历程,一些致病肠道菌譬如沙门氏菌、克雷伯氏菌等能够对合成出来的肠菌素进行糖基化修饰,使得肠菌素的骨架变长,这样经过修饰的肠菌素由于骨架变大便不能被被siderocapn蛋白捕获。这样修饰肠菌素的代价是肠菌素不能保持像本体状态那样对铁离子的极高的亲和力,但是却能够逃避siderocapn免疫蛋白的捕获,为致病肠道菌提供所必要的铁元素。逃逸宿主siderocapn蛋白免疫历程的另个机制是炭疽杆菌的“偷袭机制”,它并不是在原有的铁载体基础上对其进行修饰,而是在铁载体合成历程中利用了一种在其他铁载体中很少见的3,4-二羟基苯甲酸亚体,通过这个亚体上的氧原子与铁进行配位,与铁配位后,Rebecca等人证实这种铁载体在与siderocapn蛋白作用时会产生空间位阻,使得siderocapn免疫蛋白无法捕获这种特殊的铁载体。霍乱弧菌是霍乱的病原体,能够引起呕吐、腹泻等症状。弧菌素是霍乱弧菌在低铁环境下合成的一种儿茶酚型铁载体,关于弧菌素分子与铁离子的配位方式,Griffiths等人认为其第二个恶唑环上的氮原子也参与了配位,即五个氧原子和一个氮原子与铁配位,而Miethke等人认为是三个儿茶酚亚体上的六个氧原子与铁进行配位,那么弧菌素分子到底通过什么原子和铁离子配位,它是否也能逃逸siderocapn蛋白的免疫历程。并且,在体外环境中结合了铁离子之后,弧菌素分子是如何被识别并转运至霍乱弧菌细胞内部被利用也是人们比较关心的一个不足,这些都可以通过结构生物学的手段来解决。在弧菌素分子由细胞外转运至细胞内的历程中,ViuP蛋白是其中的周质空间转运蛋白,它的作用是把带铁弧菌素由外膜孔蛋白ViuA转运到内膜上的ABC系统ViuDGC蛋白,在带铁弧菌素的运输中起到了承前启后的作用。我们的课题的第一部分就是试图通过剖析Viup蛋白和ViuP与带铁弧菌素复合物的分子结构,来阐明ViuP蛋白与弧菌素分子的作用机制,以及弧菌素分子与铁离子真正的配位方式。通过这部分的实验,我们得到了以下结果：1) ViuP蛋白分子整体结构是两个相对独立的球状结构域被一段α螺旋结构连接,属于第三类周质空间转运蛋白家族,在带铁弧菌素结合论文导读：
前和结合后ViuP蛋白的整体结构基本上不发生显著变化；2)通过比较ViuP蛋白和其他儿茶酚型铁载体转运蛋白的三维结构,发现ViuP蛋白的弧菌素结合口袋的方向与其他的铁载体转运蛋白的底物结合口袋的方向相反,由此,ViuP蛋白以进化角度上来说可能来源于不同于其他的铁载体转运蛋白的新的家族；3) ViuP与带铁弧菌素的复合物的高分辨率结构(1.45A)证实弧菌素分子是通过五个氧原子和一个氮原子与铁离子配位,这种独特的配位方式使带铁弧菌素分子体现出两个单位的负电荷；4)通过对siderocapn蛋白的荧光淬灭实验,表明siderocapn不能像螯合肠菌素分子那样高效地捕获带铁弧菌素分子,浅析判断可能与带铁弧菌素分子特殊的铁配位形式有关。本课题的另一部分是关于肠菌素分子的周质空间转运蛋白的结构和功能浅析。作为最高效的儿茶酚型铁载体,肠菌素结合蛋白目前已有一些探讨,其外膜结合蛋白FepA的结构于1999年被发表。FepA蛋白识别并结合带铁肠菌素分子后,将肠菌素转运到周质空间,在周质空间内,再由FepB蛋白将带铁肠菌素分子转移给内膜上的ABC转运系统。FepB蛋白是如何识别并转运肠菌素分子,它与下游的ABC转运蛋白是如何相瓦作用的,我们通过剖析FepB蛋白与带铁肠菌素复合物的结构对这些不足有了初步的回答。通过这部分的结构与功能实验,我们得到了以下实验结果：1) FepB蛋白分子整体结构也是两个相对独立的球伏结构域被一段α螺旋结构连接,符合第三类周质空间转运蛋白家族的基本特点；2)通过比较FepB蛋白和ViuP蛋白以及其他的儿茶酚型铁载体转运蛋白的三维结构发现,FepB蛋白的肠菌素结合的口袋方向与ViuP蛋白一致,而与其他的铁载体转运蛋白都相反,这说明FepB蛋白可能与ViuP蛋白来源于同一个进化的家族,而不是目前已经报道的其他的铁载体转运蛋白家族；3)复合物结构的一个重要特点是FepB蛋白与带铁肠菌素分子是以3：4的比例结合,每三个结合了肠菌素分子的FepB蛋白中间还结合了一个额外的带铁肠菌素分子,这种结合比例方式在其他铁载体转运蛋白中以未见报道。通过对加入不同浓度肠菌素分子的FepB蛋白溶液的动态光散射实验,我们发现高浓度的带铁肠菌素分子能够使FepB蛋白的聚合态由单体转变为三体,据此我们推测,FepB蛋白除了具有转运肠菌素的作用,可能还具有储存带铁肠菌素的功能,以而防止冗余的带铁肠菌素分子通过TolC系统溢出,提升了大肠杆菌对肠菌素分子的利用率；4)通过序列比对和结构叠合我们找到了FepB蛋白上可能与下游FepDG蛋白作用的两个保守的酸性氨基酸残基Glu-109和Glu-251。在验证这两个氨基酸残基的重要量时我们发现这两个氨基酸的重要程度并不一致。Glu-251氨基酸突变掉之后,回补的fepB敲除的大肠杆菌在限铁LB平板上不能正常生长,而Glu-109氨基酸突变掉之后,回补的fepB敲除的大肠杆菌却依然能够正常生长。可能是由于Glu-251突变掉之后FepB蛋白不能识别下游的ABC转运蛋白,而FepB蛋白的Glu-109突变体依然能够识别下游ABC转运蛋白并将带铁肠菌素传递下去,这说明在识别下游ABC转运蛋白的历程中,FepB蛋白的C端结构域可能发挥了更重要的作用。关键词：铁载体论文弧菌素论文肠菌素论文周质空间转运蛋白论文铁配位论文免疫系统论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要6-9
Abstract9-14
符号说明14-15
第一章 前言15-32

1.1 铁载体的分类及依据16-17

1.2 关于铁载体的生物合成17-18

1.3 铁载体的转运系统18-25

1.3.1 TonB依赖的铁载体转运途径18-19

1.3.2 周质空间的铁载体转运19-22

1.3.3 内膜ABC转运系统22-23

1.3.4 周质空间转运蛋白与内膜ABC转运蛋白的相互作用23-24

1.3.5 铁离子在细胞内的释放24-25

1.4 铁载体与人体免疫系统25-26

1.5 霍乱弧菌和大肠杆菌的铁载体代谢途径26-30

1.5.1 弧菌素和肠菌素的合成途经26-29

1.5.2 弧菌素和肠菌素的转运论文导读：322.1.2试剂32-352.1.3主要仪器设备352.1.4实验策略35-402.2实验结果40-502.2.1ViuP蛋白的分离纯化40-442.2.2Se-ViuP蛋白的分离与纯化44-472.2.3FepB蛋白的分离与纯化47-502.3结晶筛选和晶体的优化50-522.3.1结晶策略：悬滴气相扩散法进行晶体生长502.3.2ViuP、Se-ViuP蛋白的晶体生长50-512.3.3ViuP-弧菌素复合物
途径及ViuP,FepB蛋白的重要量29

1.5.3 大肠杆菌周质空间中过量肠菌素的泄漏29-30

1.6 课题探讨的内容和革新点30-32

第二章 ViuP-弧菌素,FepB-肠菌素复合物的表达,纯化与结晶32-54

2.1 实验材料和策略32-40

2.

1.1 实验材料32

2.

1.2 试剂32-35

2.

1.3 主要仪器设备35

2.

1.4 实验策略35-40

2.2 实验结果40-50

2.1 ViuP蛋白的分离纯化40-44

2.2 Se-ViuP蛋白的分离与纯化44-47

2.3 FepB蛋白的分离与纯化47-50

2.3 结晶筛选和晶体的优化50-52

2.3.1 结晶策略：悬滴气相扩散法进行晶体生长50

2.3.2 ViuP、Se-ViuP蛋白的晶体生长50-51

2.3.3 ViuP-弧菌素复合物的晶体生长与优化51-52

2.3.4 FepB-肠菌素复合物的晶体生长与优化52

2.4 本章小结52-54

第三章 晶体结构的剖析54-72

3.1 衍射数据的收集与处理54-62

3.

1.1 晶体衍射的原理54-56

3.

1.2 衍射数据的收集及处理对策56-58

3.

1.3 晶体的衍射数据处理的结果58-62

3.2 晶体结构“相位不足”的解决策略62

3.3 反常散射法确定相位不足62-65

3.1 基本原理62-64

3.2 硒代衍生蛋白反常散射波长的选择64-65

3.3 ViuP结构剖析所用到的实验策略和数据处理结果65

3.4 ViuP相位求解的实施策略和结果65

3.4 分子置换法解决相位不足65-68

3.4.1 分子置换法的基本原理65-66

3.4.2 分子的旋转和平移(Rotation and Translation)66-68

3.4.3 分子置换解决相位实施的历程和结果68

3.5 结构模型的修正68-72

3.5.1 结构修正的原理和策略68-69

3.5.2 结构修正的实施历程和结果69-72

第四章 ViuP以及ViuP-弧菌素复合物晶体结构浅析及功能探讨72-83

4.1 实验材料和策略72-73

4.

1.1 实验材料72

4.

1.2 实验策略72-73

4.2 实验结果73-81
4.

2.1 ViuP蛋白的晶体结构特点73-74

4.

2.2 弧菌素与ViuP蛋白的结合特点74-75

4.

2.3 ViuP可能来源于不同于其他铁载体结合蛋白的家族75-78

4.

2.4 特殊的铁配位方式78-79

4.

2.5 siderocapn能够以较低的亲和力结合带铁的弧菌素79-81

4.3 本章小结81-83
第五章 FepB-肠菌素复合物的结构与功能探讨83-104

5.1 实验材料与策略83-88

5.

1.1 实验材料83

5.

1.2 主要仪器设备83-84

5.

1.3 实验策略84-88

5.2 实验结果88-101
5.

2.1 FepB-肠菌素复合物的晶体结构88-89

5.

2.2 FepB的底物结合特点89-91

5.

2.3 FepB蛋白可能与ViuP蛋白来源于同一个蛋白家族91-92

5.

2.4 FepB可能还具有储存带铁肠菌素的作用92-94

5.

2.5 FepB蛋白与下游FepDG转运蛋白可能的作用方式94-97

5.

2.6 FepB蛋白的C端部分对于其识别下游蛋白发挥着更重要的作用97-101

5.3 本章小结101-104
第六章 参与的其他工作-STING蛋白的结构与功能探讨104-108
全文总结108-111
附录111-113
参考文献113-122
攻读博士学位期间发表的论文122-123
致谢123-124
外文写作一124-140
外文写作二140-156
学位论文评阅及答辩情况表156