论血小板隐丹参酮对4T1肿瘤细胞基于血小板活化而逃逸NK细胞免疫监视干预

论文导读：
摘要：立题依据：肿瘤转移是导致肿瘤患者最终死亡的首要理由,其历程主要包括肿瘤细胞以原发部位的脱离、肿瘤细胞随血液运转从及肿瘤细胞在转移部位的种植。目前,已有较多的探讨发现,血小板在肿瘤细胞转移历程中发挥着举足轻重的意义。血小板参与肿瘤转移的具体机制尚未完全清楚,其中一种重要的可能机制便是进入血液中的肿瘤细胞激活血小板,使血小板形成类似于“斗篷”的瘤栓将肿瘤细胞包裹以而使肿瘤细胞逃逸免疫体系的杀伤。清除循环血液中的肿瘤细胞大部分是要靠NK细胞来实现,由此肿瘤细胞活化血小板是导致其逃逸NK细胞免疫监视的最主要的理由。肿瘤活化其包被在表面的血小板并刺激血小板释放几点可溶性的活性因子,抑制了NK细胞的杀伤意义及生成干扰素(IFN—γ)勺能力。血小板衍生的活性成分中,TGF-β通过下调NK细胞表面免疫活性受体(NKG2D)的活性达到抑制NK细胞活性的目的。中医论述认为,肿瘤的产生与瘀血联系密切。现代医学角度分析表明,活血中药在转变血液流变学和凝固性,降低血液粘度,消除徽循环障碍方面有一定优势。已有探讨证实,隐丹参酮对肿瘤细胞有细胞毒意义,在阻碍细胞增殖和诱导细胞凋亡方面起到一定意义,同时有报道称认为隐丹参酮具有抗血小板聚集等活性。进一步探讨隐丹参酮对肿瘤细胞基于血小板活化而逃逸NK细胞免疫监视的干预意义,将为活血化瘀法以免疫相关角度预防肿瘤血行转移提供实验依据。探讨办法：通过对健康BALB/c雌小鼠眼球取血,离心分离血小板,通过流式分选技术,分离BALB/c小鼠脾脏中的NK细胞。获得二者之后,与4T1肿瘤细胞一起,建立4T1肿瘤细胞、血小板、NK细胞共培养系统,在此历程中显微镜下观察血小板与肿瘤细胞的黏附并拍摄图像；在用隐丹参酮干预之前,首先用MTT法检测隐丹参酮对4T1肿瘤细胞的自然生长的影响并绘制生长曲线,计算获得IC50浓度时,用其来进行下一步实验。建立不同的共培养模型同时用药干预并分组,包括：单独4T1肿瘤细胞组(1组),隐丹参酮干预4T1肿瘤细胞组(2组),4T1肿瘤细胞与血小板混合组(3组),隐丹参酮干预4T1肿瘤细胞与血小板混合组(4组),4T1肿瘤细胞、血小板、NK细胞混合组(5组),隐丹参酮干预4T1肿瘤细胞、血小板、NK细胞混合组(6组)。培养24小时之后,通过ELISA办法检测细胞上清液中TGF-β、IFN-γ的含量。探讨结果：MTT实验发现,隐丹参酮对于4T1肿瘤细胞增殖的抑制意义显著,IC50为16.7μmol;通过血小板提取从及与4T1肿瘤细胞混合培养观察黏附发现,肿瘤细胞确实能激活血小板,并使血小板黏附于其周围,形成球形包裹,但是,观察也发现加入隐丹参酮组和未加隐丹参酮组的黏附状态和数量未有显著不同；同时还发现,肿瘤细胞周围额外包裹一层透明膜样物质。通过流式分选获得较高纯度的NK细胞,ELISA办法检测细胞上清液中TGF-β、IFN-γ发现,单独4T1组的TGF-β均值为791.1g/ml,而加入隐丹参酮之后的4T1组TGF-β均值为551.67pg/ml,两者差别显著；4T1与血小板混合培养后TGF-β均值为2350.04pg/ml,与单独单独4T1组差别十分显著,加入隐丹参酮的4T1与血小板组TGr-β均值为2120.977pg/ml,与未加药组无显著差别;4T1与血小板和NK细胞共培养组TGF-β均值为2367.56pg/ml,加入隐丹参酮后,均值为2530.38pg/ml,两组结果无显著差别。IFN-γ检测结果为各组数据均无统计学作用。结论：混合培养表明,血小板确实能与4T1肿瘤细胞黏附,将其包裹,为支持假说肿瘤细胞激活血小板逃逸NK细胞的免疫监视提供了依据；隐丹参酮在抑制4T1肿瘤细胞增殖方面意义显著,但以黏附图像和Fpsa结果来看,它抑制血小板聚集和抑制血小板分泌TGF-β的能力都不显著；血小板确实能够分泌大量的TGF-β,而TGF-β能够抑制NK细胞的杀伤活性,该实验以细胞因子角度支持了这一结论,但是NK细胞分泌IFN-γ功能未能捡出。通过该实验说明,血小板在帮助肿瘤细胞逃逸NK细胞的免疫监视方面确实发挥了重要意义,无论以图像上还是以细胞因子角度都支持这一观点,但是,隐丹参酮抑制肿瘤细胞增殖能力显著而活血意义不太显著,下一步实验可从考虑换更有效的活血药物。关键词：免疫逃逸论文NK细胞论文血小板论文隐丹参酮论文
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Abstract7-9
缩略语表9-10
前言10-12
文献综述

一、扶正中药调节机体免疫机制的探讨发展12-18

1 增强巨噬细胞活性12
2 提升NK细胞活性12-1论文导读：
3
3 调节细胞因子的产生13-14
4 提升B细胞产生抗体的能力14-15
5 对细胞免疫的调节15-16
参考文献16-18
文献综述二：中药极为提取物调节NK细胞抗肿瘤意义探讨发展18-24
1 中药极为提取物提升NK细胞抗肿瘤活性18-19
2 中药极为提取物上调免疫推动分子的分泌19-20
3 中药极为提取物下调免疫抑制分子的分泌20
4 中药极为提取物提升NK细胞的杀瘤敏感性20-22
参考文献22-24
实验一：隐丹参酮对4T1乳腺癌细胞增殖的干预意义24-29
1 实验目的24
2 实验材料24-25
3 实验步骤25
4 统计分析办法25
5 结果25-28
6 讨论28-29
实验二：血小板与肿瘤细胞的黏附29-35
1 材料29
2 血小板提取办法29-30
3 血小板悬浮液涂片30-31
4 瑞氏染色31
5 血小板与肿瘤细胞的黏附31
6 结果31-33
7 讨论33-35
实验三：共培养模型细胞上清中TGF-β和IFN-γ的检测35-45
1 流式细胞术分选NK细胞35-39

1.1 材料和仪器35-36

1.2 办法36

1.3 结果36-39

2 共培养模型的建立39
3 ELISA检测TGF-β和IFN-γ的含量39-45

3.1 材料39-41

3.2 激活步骤41

3.3 实验步骤41-42

3.4 统计办法42

3.5 结果42-44

3.6 讨论44-45

小结45-47
致谢47-49
附图49-50
个人简历50
攻读硕士学位期间参与课题及发表论文状况50