试析氧化碳自制便携式氙气吸入装置防治一氧化碳中毒迟发性脑病站

论文导读：2次开始气体量减半，共注入气体3次。观察染毒后大鼠的症状及123下一页
DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-028

2.2013.08.014

基金项目：十堰市科委基金项目（2010-040S）；湖北省自然科学基金（2006ABA339）；湖北省卫生厅科研项目（JX2B92）；
专利号（ZL2011 2 0086891.9）
作者单位：442000湖北省十堰，湖北医药学院附属人民医院重症医学科（刘勇、王传秀、李虎年、黄光庆、杨建业），急诊科（李孝全、付守芝），超声科（白姣），临床研究所（王传秀）
通信作者：付守芝，Email：fsz188@163.com在我国一氧化碳（CO）中毒年发病率为136/20万。急性CO中毒的患者即使接受正规的治疗，也可能在中毒后3 d至4周出现一系列神经-精神障碍，称之为迟发性脑病（delayed neuropsychologic sequelae， DNS）。其发病率占全部病例的14%～40%[2-3]。轻者仅可遗留轻度认知或精神障碍，严重者甚至完全痴呆，完全丧失劳动力[4]。氙气有强大的神经保护功能[5-6]。本课题组前期通过动物研究证实氙气能够减轻CO中毒脑病的病理损害，本研究通过观察自制的氙气吸入装置对急性CO中毒动物行为学和神经细胞凋亡的影响，评估所制装备的可靠性和有效性。
1材料与方法

1.1设备情况

设计要求单独设计的氙气氧气混合器，可脱离呼吸机或麻醉机，直接应用于中枢神经系统患者，使用简单和方便。设备已获得专利证书（专利号：ZL2011 2 008689

1.9），见图1。

1.2氙气吸入系统输出气体体积分数调节原理

设置好相应气体体积分数，然后微电脑根据东莞德欣公司气体质量流量计检测气体体积分数，进行反馈，以实现设置体积分数源于：科研方法与论文写作www.7ctime.com
。基本原理为气体质量流量法[7]，见图3。其原理是在一很小直径（4 mm）的薄壁金属管（常用不绣钢、纯镍或蒙乃尔台金等耐蚀合金）的外壁，对称绕上四组电阻丝，相互联接组成惠斯顿电桥（见图2），其守桥留绕
图1设备原理图
图2气体质量流量法原理示意图组1与绕组3分内、外两层平绕于管子左侧（上游），绕组2与3则同样地绕于管子的右侧（下游）。如图2接上直流电源后，电流通过绕组而致升温，沿金届导管轴向形成一个对称分布的温度场（图中实线所示）。当气体流经导管时因气体吸热而使上游管壁温度下降，通过下游时气体放热，管壁温度上升，导致了温度场的变异，即温度最高点位置向右偏移（图2中虚线所示）。电阻丝采用电阻温度系数较大的材料能灵敏地反映温度的变化导致的电桥失衡。最后，将电桥的不平衡电压讯号放大或者转换成电流讯号。理论上输出讯号的大小正比于气体的质量流量与气体比热的乘积，可简单地表达为：
E=kCP·M A
式中：E为输出讯号；k为比例常数；
Cp为气体比热（定压）； M为气体的质量；
A为流量计各绕组与周围环境间的总传热系数。

1.3氙气吸入系统输出气体体积分数检测

设置好相应气体体积分数，然后采用脉冲氦离子化检测器（PDHID）气相色谱法检测输出气体体积分数，评估体积分数的精确程度[8]。

1.4实验材料

成年Wistar大鼠，由湖北医药学院实验动物中心供应，体质量240～280 g，自由食水，实验前1 d禁食。CO和氙气纯品气体（99.95 %） 由由佛山市科的气体化工有限公司公司提供；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒由北京中彬金桥生物技术公司提供； Morris水迷宫由中国中医研究院研制；分光光度计为CE2041（英国）；石蜡切片机为Lecia（德国）荧光显微镜为Nikon EL2000（日本）；电子照相系统为Nikon Coolpix 995（日本）；其余试剂均为市售分析纯产品。

1.5急性CO中毒大鼠模型建立

实验大鼠购入后，经适应性饲养和编号后进行1周水迷宫训练。将大鼠首先在安全岛上放置，随后依次放入4个象限中，记录巡游轨迹和入上岛时间（escape latency）。每日训练3～4次。参考付守芝等[9-10]方法制备大鼠急性CO中毒模型。按150 ml/kg腹腔注射CO纯品气体，每间隔 4 h 腹腔注射1次，从第 2 次开始气体量减半，共注入气体 3 次。观察染毒后大鼠的症状及论文导读：
体征。

1.6氙气干预

大鼠染毒30 min后，将存活大鼠36只随机（随机数字法）分为3个不同体积分数（20%，40%，60%）氙气干预组（混合25%的氧气及余气以相应体积分数的氮气补充）和1个对照组（25%氧气，75%氮气）。氙气各组的大鼠数量为10只，对照组为6只。

1.7碳氧血红蛋白（HbCO）监测

分别于中毒后15 min至4 h，断尾取血，采用尾尖采血改良双波长HbCO 定量法监测各组大鼠血HbCO 体积分数。取大鼠尾血0.1 ml加0.4 mol/L 氢氧化铵20 ml，混匀，加20 mg低亚硫酸钠混匀。10 min内于535 nm 及578 nm波长下测定其吸光度，按照下列公式计算HbCO含量（%）：
HbCO含量= （

2.44×A535/ A578-68）×100%

1.8病理学检查

颈椎脱臼处死大鼠，迅速冰面上取出脑部前额皮质及海马部分，4 μm冠状切片。常规制备石蜡切片采用苏木素- 伊红（HE） 染色观察脑组织结构及神经细胞形态。采用Tunnel 原位标记DN段法检测神经细胞凋亡情况。部分脑组织3 μm冰冻切片，具体步骤按照罗氏公司提供说明书进行。细胞核呈棕或棕褐色为凋亡细胞。在高倍镜下（×400）进行观察，每只大鼠至少取5张切片，采用Image ProPlus 6.0 图像分析系统计数凋亡细胞和总细胞，计算细胞凋亡指数（apoptosis index，AI），AI=各组切片凋亡细胞计数/各组切片总细胞计数×100%。

1.9行为学检测

大鼠行Morris水迷宫定向航行实验。水迷宫为直径120 cm、高度50 cm的圆形水池，水面高度30 cm，水温（25±1）℃。圆形平台（直径9 cm，高29 cm）位于某象限中。将大鼠分从 3个象限（非平台所在象限）之一靠池壁放入水中，记录60 s内大鼠从入水到爬上站台（设置于m象限），所需时间即逃避潜伏期。大鼠朝向墙面入水，如果 120 s中未能找到平台，则引导至平台，停留 源于：论文参考文献标准格式www.7ctime.com
30 s。水迷宫上方的摄像头同步记录大鼠运动轨迹，软件分析运动情况。连续4 d，每次实验结束，立即擦干并吹干毛发 ，放回笼中。

1.10统计学方法

计量资料采用均数±标准差（x±s）表示， 数据以SPSS 11.0进行分析。方差分析比较各实验组间HbCO含量和细胞凋亡率，组间比较采用两样本均数t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果

2.1氙气体积分数

为评估氙气体积分数调节的精确性，设定氙气50%，持续供气达10 h，定时检测出口气体体积分数。1 h后管道氙气体积分数为53.32% （50.12%～56.52%）， 氧气和氮气的体积分数各自为 32.91% （25.1%～40.72%）和 13.29% （8.02%～18.56%），具体数值见图3。氙气含量随时间累计值见图4。
图3持续给与50%氙气，管道吸入口的氙气，氮气和氧气随时间的分布
图4持续给与50%氙气，管道吸入口的蓄积氙气，氮气和氧气随时间的含量

2.2急性CO中毒大鼠模型建立

大鼠腹腔注射CO后5～10 min 出现烦躁、撞笼，15 min 后陆续出现少动、四肢瘫软、抽搐、昏迷，黏膜及肢端皮肤呈樱桃红色，部分发生角弓反张。约1/3大鼠在中毒30 min内死亡。尸检发现内脏重度充血伴散在出血点，脑组织充血水肿严重。上述症状体征持续4 h后逐渐消失。大鼠中毒后符合急性CO中毒表现。

2.3HbCO监测

图5所示大鼠注射CO后血中HbCO水平迅速升高，12～18 min达到高峰60%～70%左右，4 h后逐渐下降至50%，体内CO半衰期5～6 h， 8 h后逐渐恢复至染毒前水平。每4 h重复注射氙气可维持HbCO水平，干预组与对照组在各时点HbCO差异无统计学意义。
图5间断论文导读：S的发生率显著下降，并随体积分数增加呈一定的量效关系，表明本设备可以有效减少DNS发病率。细胞凋亡也可能是CO中毒DNS重要的病理基础之一。研究表明染毒3d后，大鼠脑内开始出现细胞凋亡，7～14d为高峰，至少持续21d。除神经细胞外，血管内皮细胞也发生明确而严重的凋亡。本研究同样观察到染毒大鼠脑组织内细胞凋亡明显。而
注射CO 的碳化血红蛋白时间分布图

2.4行为学检测

经水迷宫试验检测，对照组（n=6）中巡游轨迹以圆周式和随机式为主。氙气干预组中，除最低剂量组（20%）外，大多数大鼠巡游轨迹仍然以直线式或趋向式为主，DNS率显著低于对照组（图6）。随氙气剂量增加，潜伏期进行性缩短，呈现一定剂量效应关系。各组间差异具有统计学意义（F=44.46，P=0.00）。但氙气体积分数增加到60%，凋亡的程度并无随之继续显著下降（t=

1.98，P=0.06）。

40%和60%组间比较，t=

1.98，aP=0.06

F=44.46，bP=0.00
图6各组水迷宫测试的潜伏期

2.5细胞凋亡检测

经TUNEL染色，凋亡细胞核呈现深棕色，正常细胞核呈浅蓝色。对照组组织形态紊乱，并可观察到较多凋亡细胞（图7）。氙气干预组中，20%组和40%组可观察到部分凋亡细胞，但凋亡率仍然显著低于对照组，并随体积分数增加凋亡程度进一步减轻（t=0.87，P=0.39）。但体积分数继续增加到40%以上时，细胞凋亡程度并不随之继续改善40%组和60%组脑组织结构完整，细胞数量较多，两组细胞凋亡差异不明显（P=0.39）（图8）。
图7TUNEL染色的脑组织凋亡病理切片（×400）
F=19

5.18，aP=0.00；40%和60%组比较，t=0.87，bP=0.39

图8定量显示脑细胞TUNEL染色的凋亡程度3讨论
本研究证明氙气对于CO中毒具有减少发病率及减轻神经损害的作用[9-11]，但腹腔注射法不符合生理要求，在临床上不可能推广使用。建立一种简便可靠的氙气吸入装置是临床应用的基本条件和要求。笔者设计了一种便携式氙气吸入装置 ，评估其可靠性和有效性。设定的氙气体积分数下，监测呼出装置的体积分数能持续稳定的基本设置，符合设计要求。累计氙气体积分数也达到设计要求。以上表明本设备的氙气调节达到临床要求。
本模型采用腹腔注射CO 法进行染毒，注射后血中HbCO 可于15 min 内迅速升至重度中毒水平，大鼠出现严重CO中毒表现，血液携氧能力明显降低，从而造成组织缺氧。采用腹腔注射途径染毒虽与临床所见急性CO中毒的CO侵入途径不同，但中毒机制相符。CO吸入中毒模型被广泛应用于相关研究，临床表现和病理特点与CO吸入法并无明显差异[12-13]，此外，注射法还具有以下优点：操作简便，毒剂量容易控制，影响因素少，便于及时监控染毒动物血中HbCO水平，并可避免吸入染毒可能出现的缺氧因素对实验结果的影响。所需CO量明显减少，对设备仪器条件亦无特殊要求。实验表明大鼠接受CO注射后，呈现典型急性CO中毒变化，HbCO监测进一步证实大鼠血液中CO含量与急性CO中毒一致。
水迷宫实验是判断大鼠学习和记忆能力的重要指标[14-15]。然而水迷宫实验受动物个体差异影响较大。因此本试验首先对动物进行训练和筛选，淘汰学习记忆能力较差的动物，最大程度提高结果的可靠性。研究表明大鼠染毒后出现智力下降，符合DNS表现。采用本装置成功的改善了行为学测试指标，DNS的发生率显著下降，并随体积分数增加呈一定的量效关系，表明本设备可以有效减少DNS发病率。
细胞凋亡也可能是CO中毒DNS 重要的病理基础之一[16-17]。研究表明染毒3 d后，大鼠脑内开始出现细胞凋亡，7～14 d为高峰，至少持续21 d。除神经细胞外，血管内皮细胞也发生明确而严重的凋亡。本研究同样观察到染毒大鼠脑组织内细胞凋亡明显。而利用本装置吸入氙气可以显著降低凋亡细胞数，且呈一定程度的量效关系，表明本装置具有临床价值。尽管本动物研究表明此装置的可靠性和有效性，但人体的可靠性和有效性研究需要进一步评估，以确保安全和最大临床效果。 摘自：硕士论文格式www.7ctime.com