探讨软骨基于海藻酸凝胶微球动态培养系统建立及其运用于软骨组织工程

论文导读：
摘要：关节软骨损伤临床治疗办法长期效果不佳。软骨组织工程有希望成为临床治疗新案例,但还有着诸多挑战。其中,软骨细胞体外扩增和间充质干细胞成软骨分化都是亟待解决的瓶颈不足。海藻酸可在细胞相容性良好的条件下形成水凝胶,提供三维培养环境,推动软骨细胞表型的维持；力学刺激是软骨组织构建历程中的重要因素。由此,本探讨旨在使用海藻酸凝胶微球包埋软骨细胞或间充质干细胞,结合转瓶生物反应器,建立三维动态培养方式,考察其运用于软骨种子细胞扩增和分化诱导。首先,在此培养系统中考察第1代及第4代兔关节软骨细胞(rabbit articular chondrocytes, rACs)的生长和分化。通过在诱导条件下培养35天,然后将载细胞微球移植到裸鼠皮下4周,发现该系统并不能有效地长期维持rACs表型或诱导去分化的rACs再分化,但能抑制细胞肥大。其次,在三维动态培养系统中对兔间充质干细胞(rabbit mesenchymal stem cells, rMSCs)进行诱导分化。结果发现,虽然其可从有效地发生成软骨分化,但在后期出现了肥大化现象,而且rMSCs在该系统内活性较低,出现大量的死亡之后,基于上面陈述的三维动态培养系统,将Fe3O4纳米粒子引入海藻酸凝胶微球,建立可分离两种不同细胞的新型共培养系统,并确立了合适浓度的Fe3O4和海藻酸凝胶。最后,在新型三维动态培养系统中进行rMSCs与rACs的共培养。实验分为两组分别利用诱导培养基和含2%FBS的诱导培养基。在利用诱导培养基的条件下,rMSCs出现大量死亡,与单独培养相比,共培养系统中的rMSCs可从分泌更多的GAG,Ⅱ型胶原基因表达上调,但同时Ⅰ型胶原基因表达也上调；相反,在含2%FBS的诱导培养基条件下,rMSCs并未出现大量死亡,但共培养的rMSCs分泌的GAG却低于单独培养的rMSCs,且单独诱导的rMSCs表达更高的Ⅱ型胶原；所有条件下X型胶原基因表达都维持很低的水平,表明细胞肥大得到抑制。在对人羊膜间充质干细胞(human amonitic membrane-derived MSCs, hAMSCs)的诱导中发现,尽管细胞活性较rMSCs有很大提升,该新型系统对hAMSCs的诱导效果不佳,这可能与hAMSCs的羊膜来源有关。综上所述,基于海藻酸凝胶微球的动态培养系统并不能长期有效的维持rACs表型,但能抑制其肥大化,可从诱导rMSCs成软骨分化,但不能抑制肥大化；开发的新型可实施细胞分离的共培养系统可从诱导rMSCs成软骨分化,也能抑制肥大化,但对hAMSCs成软骨诱导效果不佳。由此,通过进一步优化,该培养系统将能够有助于软骨组织工程探讨。关键词：软骨组织工程论文间充质干细胞论文软骨细胞论文三维动态培养论文海藻酸凝胶微球论文
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Abstract6-13
第1章 绪论13-24

1.1 关节软骨组织简介13-14

1.2 关节软骨缺损及临床常用治疗办法14-16

1.3 软骨组织工程16-22

1.3.1 种子细胞17

1.3.2 支架材料17-19

1.3.3 生长因子19

1.3.4 共培养技术在软骨组织工程中的运用19-20

1.3.5 三维动态培养20-21

1.3.6 共培养系统中的细胞分离21-22

1.4 本论文的主要作用及探讨目的22-24

第2章 基于海藻酸凝胶微球动态培养rACs24-45

2.1 引言24-25

2.2 实验材料与办法25-31

2.1 实验动物25

2.2 实验试剂25-27

2.3 实验器材27

2.4 主要仪器27

2.5 兔软骨细胞的分离,冷冻保存,培养和扩增27-28

2.6 细胞包埋28

2.7 死活荧光染色28

2.8 MTT检测28-29

2.9 DNA含量测定29

2.10 GAG含量测定29

2.11 组织化学染色29

2.12 免疫荧光染色29

2.13 qRT-PCR29-30

2.14 扫描电镜观察30

2.15 动物实验30

2.16 数据处理30-31

2.3 实验结果31-42

2.3.1 兔软骨细胞论文导读：815.3.1rMSCs与rACs的三维动态共培养76-785.3.2hAMSCs与rACs的三维动态共培养78-815.4讨论81-825.5小结82-83第6章全文总结与展望83-86

6.1全文总结83-842未来展望84-86参考文献86-96致谢96上一页12

形态31

2.3.2 细胞死活染色31

2.3.3 细胞活性31-32

2.3.4 DNA含量32-33

2.3.5 GAG含量33-34

2.3.6 组织化学染色34

2.3.7 免疫荧光染色34-36

2.3.8 qRT-PCR36-37

2.3.9 皮下移植实验37-42

2.4 讨论42-43

2.5 小结43-45

第3章 基于海藻酸凝胶微球动态培养条件下rMSCs的成软骨分化45-52

3.1 引言45-46

3.2 实验材料与办法46-47

3.

2.1 实验动物46

3.

2.2 实验试剂46

3.

2.3 rMSCs的分离,冷冻保存和传代培养46

3.

2.4 细胞包埋46

3.

2.5 死活荧光染色46-47

3.

2.6 MTT检测47

3.

2.7 DNA含量测定47

3.

2.8 GAG含量测定47

3.

2.9 RT-PCR47

3.

2.10 数据处理47

3.3 实验结果47-48

3.1 细胞死活荧光染色47

3.2 诱导条件下rMSCs的生长与基质分泌47-48

3.3 RT-PCR48

3.4 讨论48-51

3.5 小结51-52

第4章 可简便分离共培养中两种细胞的新型动态共培养系统的建立52-72

4.1 引言52-54

4.2 实验材料与办法54-56

4.

2.1 主要试剂及材料54-55

4.

2.2 主要仪器55

4.

2.3 含Fe_3O_4的海藻酸钠处理55

4.

2.4 细胞包埋与培养55

4.

2.5 死活荧光染色55

4.

2.6 MTT检测55

4.

2.7 DNA含量测定55

4.

2.8 GAG含量测定55

4.

2.9 细胞回收55-56

4.

2.10 细胞流式仪检测回收的rMSCs表面特点抗原56

4.

2.11 组织化学染色56

4.

2.12 数据处理56

4.3 实验结果56-69
4.

3.1 静态培养条件下Fe_3O_4对rACs活性、增殖及GAG分泌的影响56

4.

3.2 静态培养条件下Fe_3O_4对rMSCs活性和增殖的影响56-58

4.

3.3 三维动态条件下不同培养基中含Fe_3O_4微球内rACs的生长58-60

4.

3.4 海藻酸浓度对动态共培养中两种细胞的影响60-69

4.4 讨论69-70

4.5 小结70-72

第5章 基于新型三维动态共培养系统考察rMSCs和hMSCs成软骨分化72-83

5.1 引言72-73

5.2 实验材料与办法73-75

5.

2.1 实验试剂73

5.

2.2 细胞分离、冷冻保存、培养和扩增73-74

5.

2.3 细胞包埋74

5.

2.4 死活荧光染色74

5.

2.5 MTT检测细胞活性74

5.

2.6 DNA含量测定74

5.

2.7 GAG含量测定74

5.

2.8 组织化学染色74

5.

2.9 免疫荧光染色74

5.

2.10 RT-PCR74-75

5.

2.11 数据处理75

5.3 实验结果75-81
5.

3.1 rMSCs与rACs的三维动态共培养76-78

5.

3.2 hAMSCs与rACs的三维动态共培养78-81

5.4 讨论81-82

5.5 小结82-83

第6章 全文总结与展望83-86

6.1 全文总结83-84

6.2 未来展望84-86

参考文献86-96
致谢96