简谈受体5-羟色胺1A受体激动剂高通量筛选模型建立以及FABP_4蛋白结晶结论

论文导读：的稳转细胞株,并对该细胞株进行12代的不定期检测,信号基本维持稳定。使用该模型,筛选了实验室的化合物,筛选到1个化合物,初步推测该化合物可能是5-HTIA受体的激动剂。由此本实验所建立的模型可用于高通量5-HT1A激动剂的筛选,对于抗抑郁药的发现具有一定探讨价值。第二部分脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的结晶脂肪细胞型脂肪酸结合
摘要：第一部分5-羟色胺1A受体激动剂高通量筛选模型的建立抑郁症目前己成为世界第四大疾患,临床体现为情绪低落、悲观、睡眠障碍,严重者有自伤和冲动。中枢去甲肾上腺素、5-羟色胺、多巴胺等单胺类神经递质含量过低极为受体功能低下等都被认为是引起抑郁症的理由。目前,由于生活压力日益增大从及几点家族基因遗传,抑郁症患者数量逐渐增加,这使得抑郁症成为全球公共健康中的一大主要不足。5-HT1A受体是5-HT受体家族中第一个被克隆出来的亚型。人类遗传学和图像学探讨表明5-HT1A受体与焦虑症、抑郁症、精神分裂症等一系列精神疾病有关,目前临床探讨表明,其激动剂能有效改进抑郁症和焦虑症。由此,开发和寻找5-HT1A受体的激动剂具有重要作用,而构建稳定表达人源5-HTIA受体是该受体激动剂筛选的重要办法和手段。本论文中为了寻找5-羟色胺1A(5-HT1A)受体的激动剂,通过报告基因活性检测的办法建立高通量筛选(HTS)细胞模型。首先将带有人源5-HT1A受体的真核表达质粒pcDNA3.1(pcDN A3.1-h5-HT1AR)与带有报告基因pCRE-luc的pcDNA3.1质粒(pcDNA3.1-pCRE-luc)共转染到工具细胞中,通过对工具细胞的选择、共转染质粒的比例、化合物孵育时间及阳性化合物的选择等条件进行探索和优化,建立了一个可从稳定表达人源5-HT1A受体并可用于该受体激动剂筛选的细胞模型(HEK293-h5-HT1AR)。实验结果发现：根据瞬转实验中信号值的高低,采取HEK293细胞作为工具细胞；根据瞬转实验中的信噪比,实验发现pcDNA3.1-h5-HT1AR:pcDNA3.1-pCRE-luc的最佳比例为1：3；对化合物孵育时间进行优化,选择的最佳孵育时间为6小时；阳性化合物的选择历程中,实验探讨了5-HT.HC1, Fpbanserin,8-OH-DPAT从及Lorcaserin(APD356)四个已报道有5-HT1A受体激动活性的化合物,最后结果表明APD356在该系统中最适合作为阳性化合物。基于从上条件,构建稳定表达5-HT1A受体的稳转细胞株,并对该细胞株进行12代的不定期检测,信号基本维持稳定。使用该模型,筛选了实验室的化合物,筛选到1个化合物,初步推测该化合物可能是5-HTIA受体的激动剂。由此本实验所建立的模型可用于高通量5-HT1A激动剂的筛选,对于抗抑郁药的发现具有一定探讨价值。第二部分脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的结晶脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP4/AP2)是第一个被发现的脂肪酸结合蛋白,分布广泛,在脂肪细胞和巨噬细胞中表达较高。该基因的缺陷可从改进胰岛素抵抗,并且可从抑制动脉粥样硬化从及炎症的发生,由此,FABP4已成为治疗糖尿病从及粥样硬化的重要靶标。基于从上探讨价值,探讨人员积极寻找FABP4的新型小分子抑制剂。本实验室在体外筛选到系列FABP4巴标抑制活性较高的化合物,希望进一步了解其蛋白及小分子化合物的结合方式便于化合物的改造。本项探讨主要借助大肠杆菌表达系统大量表达FABP4蛋白,并对该蛋白进行纯化,获得了纯度较高的FABP4蛋白,用于化合物和蛋白的共晶实验。关键词：激动剂论文高通量筛选论文5-羟色胺1A受体论文抑郁症论文G蛋白偶联受体论文脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP_4)论文晶体论文纯化论文抑制剂论文
本论文由www.7ctime.com,需要可从关系人员哦。第一部分 5-羟色胺1A受体激动剂高通量筛选模型的建立4-32
中文摘要4-5
Abstract5-6
符号说明6-7
第一章 文献综述7-15
1 G蛋白偶联受体介绍7-9

1.1 G蛋白偶联受体的分类7-8

1.2 G蛋白偶联受体信号通路8-9

2 5-羟色胺(5-HT)受体家族介绍9-11
3 5-羟色胺受体(5-HT_(1A)R)介绍11-14

3.1 5-羟色胺1A受体(5-HT_(1A)R)基因定位11

3.2 5-羟色胺1A受体(5-HT_(1A)R)组织分布11

3.3 5-羟色胺1A受体(5-HT_(1A)R)功能11-13

3.3.1 5-羟色胺1A受体(5-HT_(1A)论文导读：杆菌体会态细胞162.2细菌的转化16-172.3细胞培养172.4MTT比色法检测细胞活力172.5细胞转染17-182.5.1瞬时转染办法17-182.5.2稳定表达人源5-HT_(1A)受体细胞模型的建立182.6系统活性检测原理及办法18-193实验结果19-283.1工具细胞的选择19-203.2质粒共转比例摸索20-213.3FSK系统浓度的确定213.4化合物孵育时间的
R)与抑郁症的联系11-12

3.2 5-羟色胺1A受体(5-HT_(1A)R)与其他疾病的联系12-13

3.4 5-羟色胺1A受体(5-HT_(1A)R)激动剂探讨发展13-14

3.4.1 5-羟色胺1A受体(5-HT_(1A)R)现有激动剂13

3.4.2 5-羟色胺1A受体(5-HT_(1A)R)激动剂筛选原理13-14

4 结语14-15
第二章 五羟色胺1A受体(5-HT_(1A)R)激动剂筛选平台的建立与激动剂的筛选15-30
1 材料与办法15-16

1.1 耗材与试剂15

1.2 主要仪器15-16

2 实验办法16-19

2.1 氯化钙法制备大肠杆菌体会态细胞16

2.2 细菌的转化16-17

2.3 细胞培养17

2.4 MTT比色法检测细胞活力17

2.5 细胞转染17-18

2.5.1 瞬时转染办法17-18

2.5.2 稳定表达人源5-HT_(1A)受体细胞模型的建立18

2.6 系统活性检测原理及办法18-19

3 实验结果19-28

3.1 工具细胞的选择19-20

3.2 质粒共转比例摸索20-21

3.3 FSK系统浓度的确定21

3.4 化合物孵育时间的摸索21-22

3.5 不同激动剂对信号的影响22-26

3.5.1 5-HT.HCl22-23

3.5.2 Lorcaserin(APD356)23-24

3.5.3 Fpbanserin24-25

3.5.4 8-OH-DPAT25-26

3.6 稳定表达人源5-HT_(1A)受体细胞模型的建立26-27

3.6.1 抗生素G418筛选浓度的确定26

3.6.2 稳定表达人源5-HT_(1A)受体细胞株的检测26-27

3.7 化合物筛选27-28

4 讨论28-30
参考文献30-32
第二部分 脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的结晶32-49
中文摘要32-33
Abstract33-34
1 前言34-36
2 材料与办法36-41

2.1 耗材与试剂36

2.2 主要仪器36-37

2.3 溶液配制37-40

2.4 实验办法40-41

2.4.1 FABP_4蛋白表达40

2.4.2 FABP_4蛋白纯化40-41

2.4.3 FABP_4蛋白结晶41

3 实验结果41-45

3.1 FABP_4蛋白纯化实验结果41-42

3.2 纯化实验中分子筛缓冲液的选择42-43

3.3 FABP_4蛋白结晶极为条件优化43-45

3.1 FABP_4蛋白结晶实验43-44

3.2 FABP_4蛋白与化合物共晶实验44-45

4 讨论45-47
参考文献47-49
致谢49-50
攻读硕士学位期间论文发表状况50-51