试论细胞间充质干细胞和内皮祖细胞对造血干/祖细胞体外扩增效力作用

论文导读：数量均增多，但MSC组和EPC组MNCs扩增倍数显著大于对照组，EPC组更为明显。第4d，MSC组MNCs数约为对照组的1.71倍（**，p0.01），EPC组MNCs数约为对照组的2.93倍（*，p0.05）。第7d，MSC组MNCs数约为对照组的1.38倍（*，p0.05），EPC组MNCs数约为对照组的2.10倍（**，p0.01），EPC组MNCs数约为MSC组的1.53倍（**，p0.01）。2.共培养7d后，流式细胞术分
摘要：目的：探讨脐带组织来源的间充质干细胞(MSCs）和内皮祖细胞（EPCs）对脐血造血干/祖细胞（HSCs/HPCs）体外扩增效力的意义极为简要机制。办法：正常新生儿脐带中分离MSCs，以免疫表型CD14、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、HLA-ABC，从及向脂肪细胞、成骨细胞分化的潜能两方面进行鉴定。以免疫表型CD31、CD34、CD133、CD146的分析对EPCs进行鉴定。将MSCs和EPCs分别用丝裂霉素C处理后制备成细胞滋养层。实验共设三组：（1）对照组（无细胞滋养层）；（2）MSC组（MSCs滋养层）；（3）EPC组（EPCs滋养层）。正常新生儿脐血中分离单个核细胞（MNCs），流式细胞术检测其中HSCs/HPCs所占比例。分别接种相同数量的MNCs于两种细胞滋养层或仅于培养液中，观察共培养第4d、第7d三组MNCs的扩增状况。分别将三组中扩增前、共培养第4d、共培养第7d的相同数量的MNCs接种于纤维素培养基，7~10d后观察这几个阶段HSCs/HPCs形成集落的数量和体积。流式细胞术检测扩增前后HSCs/HPCs表面抗原CD34的表达，从及共培养第1、3、5、7天各组MNCs的增殖状况。分别收集MSCs和EPCs经丝裂霉素C处理后培养24h的上清液及对照组上清液。ELISA法检测细胞因子IL-3、IL-6、SCF、TPO、Flt3L、VEGF的水平，并进行对比。结果：1.共培养第4d及第7d，镜下观察和台盼蓝染色计数的结果显示：三组MNCs数量均增多，但MSC组和EPC组MNCs扩增倍数显著大于对照组，EPC组更为明显。第4d，MSC组MNCs数约为对照组的1.71倍（**，p0.01），EPC组MNCs数约为对照组的2.93倍（*，p0.05）。第7d，MSC组MNCs数约为对照组的1.38倍（*，p0.05），EPC组MNCs数约为对照组的2.10倍（**，p0.01），EPC组MNCs数约为MSC组的1.53倍（**，p0.01）。2.共培养7d后，流式细胞术分析三组HSCs/HPCs CD34的表达，结果显示：三组CD34+CD45-HSCs/HPCs比例均较扩增前下降，EPC组下降幅度最明显，MSC组最不明显。扩增前CD34~+CD45~-的HSCs/HPCs占MNCs的2.20%。共培养7d后，对照组CD34+CD45-的HSCs/HPCs占MNCs的1.40%；MSC组CD34+CD45-的HSCs/HPCs占MNCs的1.85%；而EPC组CD34~+CD45~-的HSCs/HPCs仅占MNCs的0.41%。3.集落形成实验结果显示：7~10d后，MSC组HSCs/HPCs形成的集落数量较另两组多，且同类型集落体积较另两组大。共培养第4d的HSCs/HPCs接种于纤维素培养基7~10d后，MSC组HSCs/HPCs集落形成总数为对照组的2.55倍（**，p0.01），为EPC组的2.47倍（**，p0.01）；共培养第7d的HSCs/HPCs接种于纤维素培养基7~10d后，MSC组HSCs/HPCs集落形成总数为对照组的3.73倍（**，p0.01），为EPC组的3.45倍（**，p0.01）；EPC组与对照组的集落形成总数和体积无明显差别。4.流式细胞术分析MNCs增殖状况，结果显示：共培养第1、3、5、7d分别检测，可见三组CFSE荧光强度均减弱，即三组细胞均增殖；MSC组和EPC组荧光强度减弱幅度较对照组大，即细胞增殖程度较对照组大，EPC组更为明显。5. ELISA法检测三组培养上清液中6种细胞因子水平，结果显示：IL-3、Flt3L的水平差别无统计学作用；MSC组上清液IL-6水平较对照组和EPC组明显升高（p0.01），EPC组较对照组升高（p0.01）；EPC组上清液SCF水平较对照组和MSC组明显升高（p0.01）；EPC组TPO水平较对照组升高（p0.01）；MSC组和EPC组VEGF水平较对照组明显升高（p0.01）。结论： MSCs是较EPCs更适合HSCs/HPCs体外扩增的细胞滋养层，可为其提供适宜的细胞微环境。MSCs有助于维持HSCs/HPCs表达CD34并可抑制其分化，保持其造血重建潜能和归巢能力，这可能与IL-6的意义联系密切；论文导读：6-272.3实验结果27-302.3.1人脐带来源MSCs的分离培养与鉴定27-292.3.2人脐带来源EPCs的鉴定极为培养条件的比较29-302.3.3人脐血来源HSCs/HPCs的鉴定302.4讨论30-32第3章滋养层细胞对HSCs/HPCs体外扩增的影响32-413.1实验材料32-333.1.1主要材料323.1.2实验试剂323.1.3主要仪器32-333.2实验办法333.2.1扩
而EPCs有效推动HSCs/HPCs向成熟血细胞的分化，可能与其分泌大量TPO相关。关键词：造血干/祖细胞论文体外扩增论文间充质干细胞论文内皮祖细胞论文细胞因子论文
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中文摘要5-7
Abstract7-13
第1章 绪论13-21

1.1 综述13-19

1.1 造血干细胞的生物学特性13

1.2 造血干细胞的表面标志13-15

1.3 造血干细胞的体外扩增培养15-19

1.4 造血干细胞的临床运用19

1.2 探讨目的及作用19

1.3 探讨案例及内容19-21

第2章 滋养层细胞的分离鉴定及共培养系统的建立21-32

2.1 实验材料21-24

2.

1.1 主要材料21

2.

1.2 实验试剂21-22

2.

1.3 实验溶液配制22-23

2.

1.4 主要仪器23-24

2.2 实验办法24-27

2.1 人脐带来源 MSCs 的分离培养与鉴定24-25

2.2 人脐带来源 EPCs 的鉴定极为培养条件的比较25

2.3 人脐血来源 MNCs 的分离与 HSCs/HPCs 的鉴定25-26

2.4 滋养层细胞的制备及接触共培养26-27

2.3 实验结果27-30

2.3.1 人脐带来源 MSCs 的分离培养与鉴定27-29

2.3.2 人脐带来源 EPCs 的鉴定极为培养条件的比较29-30

2.3.3 人脐血来源 HSCs/HPCs 的鉴定30

2.4 讨论30-32

第3章 滋养层细胞对 HSCs/HPCs 体外扩增的影响32-41

3.1 实验材料32-33

3.

1.1 主要材料32

3.

1.2 实验试剂32

3.

1.3 主要仪器32-33

3.2 实验办法33
3.

2.1 扩增前后 MNCs 扩增倍数的对比33

3.

2.2 扩增前后 CD34~+CD45-HSCs/HPCs 比例的变化33

3.

2.3 扩增前后 HSCs/HPCs 集落形成能力的变化33

3.

2.4 扩增历程中 MNCs 的增殖状况33

3.3 实验结果33-40

3.1 扩增前后三组 MNCs 扩增倍数的对比33-35

3.2 扩增前后 CD34~+CD45~-HSCs/HPCs 比例的变化35-36

3.3 扩增前后 HSCs/HPCs 集落形成能力的变化36-38

3.4 扩增历程中 MNCs 的增殖状况38-40

3.4 讨论40-41

第4章 滋养层细胞培养上清液中细胞因子的水平极为探讨作用41-46

4.1 实验材料41-42

4.

1.1 主要材料41

4.

1.2 实验试剂41

4.

1.3 实验溶液配制41-42

4.

1.4 主要仪器42

4.2 实验办法42-44
4.

2.1 滋养层细胞培养上清液的制备42

4.

2.2 上清液中 IL-6 和 VEGF 的检测42-43

4.2.3 上清液中 IL-

3、SCF、TPO 和 Flt3L 的检测43-44

4.3 实验结果44

4.4 讨论44-46

第5章 结论与展望46-47
参考文献47-54
作者介绍及在学期间所取得的科研成果54-55
致谢55