试谈抗原伪狂犬病毒gB基因在毕赤酵母中表达及初步运用

论文导读：
摘要：伪狂犬病(Pseudorabies, PR)又称Aujeszky's病,其病原伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)是疱疹病毒科(Herpes viridae),α-疱疹病毒亚科(Alpha herpes viridae)的成员,基因组大小约150Kb,G+C含量高达73%,是一种线状双链DNA病毒。伪狂犬病可引起牛、羊及野生动物的发热、奇痒(除猪外)、脑脊髓炎等症状,猪是伪狂犬病毒(PRV)的天然宿主和主要感染源。伪狂犬病是世界性的重要传染病之一,给我国养猪业造成了巨大的经济损失,其危害仅次于猪瘟和口蹄疫。经探讨发现，囊膜糖蛋白gB是伪狂犬病毒(PRV)的一个重要免疫原,能介导病毒与细胞间的相互作用,属于必需糖蛋白,也是疱疹病毒中最为保守的基因。gB糖蛋白作为动物机体免疫系统识别的主要靶抗原,在伪狂犬病诊断和根除计划中发挥着重要的作用。本探讨选择伪狂犬病毒gB糖蛋白作为探讨对象,利用DNAMAN和Opgo6.3软件对Genebank中登录的各伪狂犬病毒(PRV)gB基因序列进行浅析,分别设计合成了3对特异性引物：一对不含酶切位点引物、一对荧光特异性引物和TaqMan探针、一对含有EcoRI和Xbal酶切位点引物。1、通过DNA/RNA提取试剂盒对PRV病毒进行DNA的提取,利用普通PCR技术获得了全长约2.8Kb的PRV-gB基因,并克隆至pMD20-T载体,成功构建了重组质粒pMD20-gB。通过基因测序和Genebank浅析其生物学特性,最终鉴定本实验室所分离PRV毒株为南阳株(Namyangju)。2、将重组质粒pMD20-gB作为阳性标准品,利用荧光特异性引物和TaqMan探针建立了一种快速检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR策略。该检测技术具有较高的灵敏性、特异性和可靠性。对阳性标准品的检测结果表明,所建立的伪狂犬病毒(PRV) TaqMan荧光定量PCR最低检测极限可达1.50×102拷贝/应,相比于普通PCR策略其灵敏度高1000倍以上,并且重复性好。同时对60份临床样品的俭测,荧光定量PCR不仅检出了普通PCR检测为阳性的样品,且检出了2份普通PCR未检出的样品,进一步证实了该策略快速、灵敏性好,可用于PRV感染的早期快速定量检测和肉类食品进出口检疫。3、为获得大量的、成本较低的gB诊断抗原,本探讨中用含有EcoRI和Xbal酶切位点的特异性引物,利用普通PCR技术以重组质粒pMD20-gB为模板,重新扩增gB基因全序列,成功构建了含gB主要杭原表位基因的Pichia酵母分泌表达载体pPICZαA-gB,并通过测序和DNAMAN软件浅析表明该基因无突变,蛋白编码正确无误,可继续试验。选择Pichia酵母X-33株感受态细胞转化克隆重组表达质粒pPICZαA-gB,30℃温箱培养一周左右,取单菌落液体培养,提取酵母基因组进行PCR鉴定,结果表明本探讨成功获得了可分泌表达PRV-gB主要杭原表位基因的重组菌。经1%甲醇诱导表达蛋白,通过SDS-PAGE检测目的蛋白大小约为103KD。同时探讨了目的蛋白表达量与各个培养条件的联系,优化后的最佳表达条件为：诱导初期的培养液所含菌体浓度OD600值为1.2,28.8℃摇床剧烈震荡,每24h补加甲醇终浓度为1%,诱导表达时间为72h,蛋白表达量达最大值。在最佳表达条件下所诱导表达的重组蛋白经纯化后含量达8.715mg/mL。4、将以上浓缩纯化后的重组蛋白gB作为抗原进行包被,制备ELISA抗体检测板,对PRV-gB阳性／阴性血清进行间接ELISA检测。结果显示,此目的蛋白具有很好的反应原性,可作为检测用抗原。利用己建立的gB-ELISA策略对猪瘟、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征的阳性血清进行试验,结果表明gB蛋白与其他病毒阳性血清无交叉反应,有较好的特异性,可以用于PRV-aB蛋白抗体的检测。将gB抗原免疫新西兰大白兔,通过琼脂扩散试验和中和试验测得血清抗体效价平均达到1：8,说明了gB蛋白具有很好的免疫原性。对已达到一定抗体水平的兔子采血,收集血清制备gB抗血清,为规范诊断检测试剂和实验室质量制约提供一定的物质基础。关键词：伪狂犬病毒论文gB抗原论文Pichia酵母论文分泌表达论文ELISA论文抗血清论文
本论文导读：标准曲线的建立272.4.5PRV荧光定量PCR的特异性和重复性试验27-282.4.6荧光定量PCR与普通PCR检测策略的比较及对临床样品的检测282.5伪狂犬病毒gB抗原表位基因Pichia酵母表达载体的构建及其表达28-342.5.1伪狂犬病毒gB基因含酶切位点引物的合成282.5.2gB基因的扩增与纯化28-292.5.3gB基因Pichia酵母表达载体的构建29-30
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Abstract10-12
1 前言12-22

1.1 伪狂犬病的概述12-17

1.1 国内外流行概况12

1.2 病原学12-14

1.3 流行病学14

1.4 临床症状和病理变化14-15

1.5 PRV的诊断策略与防治15-17

1.2 伪狂犬病毒gB基因的探讨进展17-20

1.2.1 伪狂犬病毒的结构特点17

1.2.2 伪狂犬病毒gB基因的结构特点17

1.2.3 伪狂犬病毒gB基因的生物学特性及功能17-18

1.2.4 伪狂犬病毒gB基因的免疫学作用18-19

1.2.5 伪狂犬病毒gB基因在预防诊断方面的探讨19-20

1.3 探讨的目的和作用20-21

1.4 探讨的内容和策略21-22

2 材料与策略22-38

2.1 试验材料22

2.2 试验用试剂及其配制22-24

2.3 伪狂犬病毒分离株的分子生物学鉴定24-26

2.3.1 PRV的增殖和病毒DNA的提取24

2.3.2 伪狂犬病毒(PRV)gB全基因引物的设计24

2.3.3 伪狂犬病毒gB基因的PCR扩增与纯化24-25

2.3.4 伪狂犬病毒gB基因克隆载体的构建25-26

2.3.5 重组质粒pMD-gB的PCR、单酶切鉴定及序列测定26

2.4 伪狂犬病毒gB基因劳光定量PCR策略的建立26-28

2.4.1 引物和探针的设计与合成26-27

2.4.2 pMD-gB阳性标准品的备27

2.4.3 PRV荧光定量PCR反应条件的优化27

2.4.4 PRV荧光定量PCR检测极限的测定和标准曲线的建立27

2.4.5 PRV荧光定量PCR的特异性和重复性试验27-28

2.4.6 荧光定量PCR与普通PCR检测策略的比较及对临床样品的检测28

2.5 伪狂犬病毒gB抗原表位基因Pichia酵母表达载体的构建及其表达28-34

2.5.1 伪狂犬病毒gB基因含酶切位点引物的合成28

2.5.2 gB基因的扩增与纯化28-29

2.5.3 gB基因Pichia酵母表达载体的构建29-30

2.5.4 伪狂犬病毒gB基因酵母表达的准备30-31

2.5.5 伪狂犬病毒gB基因在Pichia酵母中的表达31-33

2.5.6 表达蛋白SDS-PAGE电泳浅析33

2.5.7 重组蛋白表达条件的优化33-34

2.5.8 重组蛋白的纯化34

2.6 伪狂犬病毒gB抗原表位基因蛋白表达的初步运用34-38

2.6.1 表达产物间接ELISA策略的建立34-35

2.6.2 gB抗原包被条件和封闭条件的建立35

2.6.3 最适封闭液的选择35

2.6.4 gB-ELISA策略判定标准的建立35

2.6.5 gB-ELISA策略特异性试验35-36

2.6.6 重复性试验36

2.6.7 重组蛋白免疫动物36

2.6.8 抗体水平的测定36-37

2.6.9 抗血清标准物质的制备37-38

3 试验结果与浅析38-52

3.1 伪狂犬病毒分离株的分子生物学鉴定结果38-42

3.

1.1 伪狂犬病毒的增殖38-39

3.

1.2 伪狂犬病毒gB全基因的PCR扩增与纯化39

3.

1.3 伪狂犬病毒gB基因克隆体的构建39

3.

1.4 重组质粒pMD-gB的PCR、单酶切鉴定及序列测定39-42

3.2 伪狂犬病毒gB基因荧光定量PCR策略的建立42-45
3.

2.1 pMD-gB阳性标准品结果42

3.

2.2 PRV荧光定量PCR反应的条件42-43

3.

2.3 PRV荧光定量PCR检测极限的测定和标准曲线的建立43-44

3.

2.4 特异性和重复性检测44

3.

2.5 与普通PCR检测策略的比较及对临床样品的检测44-45

3.3 伪狂犬病毒gB抗原表位基因Pichia酵母表达载体的构建及其表达45-48

3.1 含酶切位点引物对伪狂犬病毒gB全基因的扩增与纯化45-46

3.2 重组表达质粒pPICZα-gB的构建46

3.3 伪狂犬病毒gB基因在Pichia酵母中的表达46-47

3.4 伪狂犬病毒gB基因在Picha酵母中的表达47-48

3.5 重组蛋白表达条件的优化48

3.6 重组蛋白的纯化48

3.4 伪狂犬病毒gB抗原表位基因蛋白表达的初步运用48-52

3.4.1论文导读：上一页123

gB重组蛋白间接ELISA策略的确立48-52

3.4.2 重组蛋白免疫效果的检测52

3.4.3 伪狂犬病毒gB基因抗血清的制备52

4 讨论52-56

4.1 伪狂犬病毒分离株的分子生物学鉴定52-53

4.2 伪狂犬病毒gB基因荧光定量PCR策略的建立53

4.3 伪狂犬病毒gB抗原表位基因Pichia酵母表达载体的构建及其表达53-54

4.

3.1 Pichia酵母表达系统的选择53-54

4.

3.2 重组蛋白抗原表位浅析鉴定54

4.4 伪狂犬病毒gB抗原表位基因蛋白表达的初步运用54-56
5 结论56-57
参考文献57-63
致谢63-64
攻读硕士学位期间发表的论文64