色氨酰-tRNA合成酶结构与功能探讨

论文片段—81引言28-292和方法29-392.1菌株、质粒、引物和试剂292.2突变体酶的构建29-312.3突变体酶的表达、纯化和定量31-342.4tRNA体外转录和纯化定量以及小螺旋tRNA的设计纯化定量34-362.5磷交换反应测定酶活化色氨酸的能力36-372.6氨基酰化反应能力的检测37-382.7小螺旋的氨基酰化38-393结果39-433.1枯草杆菌野生型T色氨酰-tRNA合成酶论文,tRNA论文,tRNA小螺旋论文,种属特异性论文,个性元件论文,
摘要：摘要氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase, aaRS)可以选择正确的氨基酸并将它转移到对应的tRNA分子的3′末端,从而确保遗传信息从DNA传递到蛋白质中的精确性学术论文格式模板。着眼于原核(枯草杆菌)和真核(人)来源的两种色氨酰-tRNA合成酶(tryptophanyl-tRNA synthetase,TrpRS)存在种属差异的区段,研究它们结构和功能的关系。序列比较揭示枯草杆菌TrpRS的K149和E153及其对应残基在不同来源的TrpRS中表现出种属差异。这两个位置的改变影响到酶催化色氨酸活化和催化tRNATrp氨基酰化的能力,这两个位置对酶的活性有贡献。对真核tRNATrp交叉氨基酰化的结果提示这两个位点的氨基酸可能参与了对tRNA的种属特异性识别论文的格式要求。真核TrpRS与原核TrpRS的羧基末端结构安排不同。原核TrpRS两个亚基的羧基端肽段彼此纠结,构成了二聚体界面的一大;而真核羧基末端的肽段却并不与另一个亚基相作用论文书写格式。发现原核TrpRS羧基末端的缺失或点突变对酶功能影响。羧基末端的改变导致酶催化氨基酸活化和氨基酰化的活力降低。原核TrpRS羧末端肽段对酶功能比较,可以影响酶对底物色氨酸的,其中R327和K328是羧基末端的残基。tRNA小螺旋的氨基酰化反应数据提示原核TrpRS的羧末端可能参与了酶与tRNA时的信号交流。人TrpRS在氨基端比其原核对应物多出约140个氨基酸。对氨基端分段缺失突变发现,人TrpRS氨基端从80位到94位的肽段是关键肽段。序列比较证实肽段在古细菌和真核来源的TrpRS中都保守。结构分析此肽段形成的一个小β-折叠结构,可能参与色氨酸活化。W88A点突变结果Trp88是肽段中的关键残基毕业论文下载。当把N94d或W88A与枯草杆菌TrpRS混合后,对真核tRNATrp的氨基酰化效果改善。枯草杆菌TrpRS催化生成的Trp-AMP可以从酶的活性中心游离出来,人变种酶的活性中心,参与氨基酰化反应一般论文格式范文。结果确认N94d和W88A催化转酰基反应的能力确实受到损害,但并不像表现出来的那样严重毕业设计论文。结果还证实氨基端的小发夹结构也影响了转酰基反应毕业论文翻译。关键词：色氨酰-tRNA合成酶论文tRNA论文tRNA小螺旋论文种属特异性论文个性元件论文
摘要5-7
ABSTRACT7-9
章 枯草杆菌色氨酰-tRNA 合成酶的K149 和E153 残基参与酶与tRNA~(Trp)的种属特异性识别9-27
摘要9
1 引言9-11
2 和方法11-13

2.1 菌株、质粒和生化试剂11

2.2 序列同源性分析11-12

2.3 枯草杆菌 TrpRS 突变体的构建和纯化12

2.4 tRNA~(Trp) 体外转录及纯化12

2.5 氨基酸活化反应的动力学测定12-13

2.6 tRNA~(Trp) 氨基酰化反应的动力学分析13

3 结果13-18

3.1 K149/E153 及其对应残基的侧链基团的电性存在种属差异13-14

3.2 K149 和 E153 的突变影响了色氨酸活化反应14-16

3.3 K149 和 E153 的改变使 TrpRS 对枯草杆菌tRNA~(Trp) 的氨基酰化活力降低16-17
3.4 枯草杆菌 TrpRS 突变体交叉催化人源tRNA~(Trp) 的氨基酰化活力增加17-18
4 讨论18-23
5 参考文献23-27
章 枯草杆菌色氨酰-tRNA合成酶羧基末端参与亚基间信号交流27-50
摘要27-28
1 引言28-29
2 和方法29-39

2.1 菌株、质粒、引物和试剂29

2.2 突变体酶的构建29-31

2.3 突变体酶的表达、纯化和定量31-34

2.4 tRNA 体外转录和纯化定量以及小螺旋tRNA 的设计纯化定量34-36

2.5 磷交换反应测定酶活化色氨酸的能力36-37

2.6 氨基酰化反应能力的检测37-38

2.7 小螺旋的氨基酰化38-39

3 结果39-43

3.1 枯草杆菌野生型 TrpRS 和变种酶表达纯化39

3.2 羧基端的缺失影响了磷交换反应活性39-40

3.3 羧基端的缺失和突变严重影响了氨基酰化反应40-42

3.4 羧基末端的残基参与了亚基间信号交流42-43

4 讨论43-46
5 参考文献46-50
章 人色氨酰-tRNA 合成酶氨基端结构与功能50-74
摘要50
1 引言50-52
2 52-53

2.1 菌株与质粒52

2.2 其它52-53

3 实验53-59

3.1 突变体的构建和鉴定53-54

3.2 蛋白质表达纯化与定量54

3.3 真核色氨酸tRNA 的表达与纯化54-56

3.4 测定磷交换反应活力56-57

3.5 氨基酰化反应活力的检测57

3.6 序列同源性分析57

3.7 真核变种酶与原核野生型酶混合氨基酰化真核 tRNATrp57-59

4 实验结果59-66

4.1 蛋白的表达与纯化59

4.2 N80d 比人野生型 TrpRS 活力高59-61

4.3 N94d 和W88A不能催化色氨酸活化,也色氨酰化tRNA61

4.4 从 80 到 94 之间的肽段在真核来源的 TrpRS 间保守61-62

4.5 原核野生型 TrpRS 可以促进 N94d 和 W88A 氨酰化真核 tRNATrp62-66
5 讨论66-71

5.1 人 TrpRS 氨基端 β 发夹结构是酶保持活力的肽段66-68

5.2 第 88 位色氨酸是发夹结构的关键位置68-69

5.3 氨基端小发夹结构对转酰基反应同样有很大影响69-71

6 参考文献71-74
发表文章目录74-75
致谢75-76