过表达大鼠ACE细胞模型建立与ACE抑制剂筛选模型探讨

论文片段—用BLAST软件与GeneBank数据库同源性分析。②HepG2细胞的转染和重组大鼠ACE蛋白的表达及检测:提取的重组质粒pEGFP-ACE,在250V,20ms的条件下电转染HepG2细胞。在转染48h后细胞,Westernblot鉴定重组ACE蛋白的表达情况;利用pEGFP载体的G418抗性,筛选出过表达ACE的细胞株。③ACE活性的测定:利用马尿酰-组氨酰-亮氨酸(hippuryl–血管紧张素转化酶抑制剂论文,抗高血压药物论文,细胞学模型论文,
摘要：目的构建pEGFP-ACE真核表达载体,并利用HepG2细胞建立过表达大鼠血管紧张素转化酶I(Angiotensin I Converting Enzyme,ACE)的细胞模型,为血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin-converting enzyme inhibitors,ACEI)类药物的筛选研究工具。方法①pEGFP-ACE真核表达载体的构建及鉴定:Trizol法提取大鼠肺组织总RNA,利用RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)的方法ACE cDNA,回收纯化目的基因,并与质粒pEGFP-C1经SalI和Acc65I双酶切的产物在T4 DNA连接酶的作用下连接,转化至感受态大肠杆菌DH5α,在含有卡那霉素(30μg/ml)的LB琼脂平板上培养过夜,挑取和筛选阳性克隆毕业论文格式设置。酶切鉴定后的阳性克隆测序,用BLAST软件与GeneBank数据库同源性分析。②HepG2细胞的转染和重组大鼠ACE蛋白的表达及检测:提取的重组质粒pEGFP-ACE,在250V,20ms的条件下电转染HepG2细胞。在转染48h后细胞,Western blot鉴定重组ACE蛋白的表达情况;利用pEGFP载体的G418抗性,筛选出过表达ACE的细胞株。③ACE活性的测定:利用马尿酰-组氨酰-亮氨酸(hippuryl–L–histidyl -L-leucine ,HHL)可在ACE的催化下迅速分解产生马尿酸(hippuric acid,HA),以高效液相色谱法(high-performance pquid chromatography,HPLC)测定反应液中的马尿酸生成量来检测ACE的活性;利用血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin-converting enzyme inhibitors,ACEI)类药物—卡托普利(captopril)对ACE活性的抑制作用对所得细胞株检测。结果①利用RT-PCR法成功大鼠ACE cDNA,重组真核表达载体经EcoRI酶切鉴定、测序及BLAST分析证实正确的重组pEGFP-ACE质粒论文 格式。②电转染HepG2细胞48h后,Western blot鉴定重组ACE蛋白在HepG2细胞中的表达,在约180KD处出现条带,并筛选稳定表达ACE的细胞株。③利用HPLC法证实过表达ACE的细胞株对HHL的催化分解作用与HepG2细胞相比有差异;利用卡托普利对ACE活性的抑制作用,检测结果卡托普利对过表达ACE细胞株具有特异性抑制作用。本实验成功构建了大鼠ACE基因的真核表达载体pEGFP-ACE,在HepG2细胞表达重组ACE蛋白,并了过表达ACE细胞株;卡托普利对细胞所表达的ACE的抑制作用,验证了本实验所构建的细胞株可作为ACEI类降压药物的筛选模型。关键词：血管紧张素转化酶抑制剂论文抗高血压药物论文细胞学模型论文
中文摘要4-6
ABSTRACT6-11
前言11-14
章：大鼠ACE 基因真核表达载体的构建14-28

1.实验仪器及14-15

2.实验方法15-20

3.结果20-25

4、讨论25-28

章：过表达大鼠ACE 蛋白细胞系的构建28-39

1.实验仪器及28-29

2.实验方法29-33

3.数据分析33

4.结果33-36

5 讨论36-39
章：HPLC 法检测ACE 活性方法的建立39-50

1.实验仪器及39

2.实验方法39-41

3.数据分析41-42

4.实验结果42-48

5.讨论48-50

50-51
参考文献51-55
综述55-64
参考文献61-64
致谢64-65
攻读学位期间发表的学术论文65-66
个人简历66