谈述受体白藜芦醇对背根神经节P2X_3/P2X_7受体介导神经病理痛作用及机理

论文导读：
摘要：探讨背景和目的：神经病理性疼痛的发病机制非常复杂，临床治愈难度较大。所以，现在对神经病理性疼痛的防治工作已经成为疼痛探讨领域的热点和重点。P2X_3和P2X_7受体与慢性神经病理痛的痛觉信息传递历程密切相关。白藜芦醇具有抗炎作用。目前尚无白藜芦醇对背根神经节P2X_3和P2X_7受体介导神经病理痛作用的探讨报道。此项探讨探讨白藜芦醇对P2X_3和P2X_7受体在背根神经节导神经病理性疼痛的作用以及其可能的机制。策略:1、采取体外纯化培养大鼠卫星胶质细胞以及坐骨神经慢性压迫性损伤(Chronic constriction injury，CCI)神经病理痛大鼠模型。2、对细胞进行以下处理:空白对照组（Ctrl）、白藜芦醇处理组（Ctrl+RES）、脂多糖（LPS）处理组、脂多糖加白藜芦醇处理组（LPS+RES）；将大鼠随机分为5组，分别是:无水乙醇生理盐水对照组（Ctrl+NS）、白藜芦醇处理对照组（Ctrl+RES）、假手术对照组(Sham)、CCI大鼠模型组（CCI）和CCI模型+白藜芦醇处理组（CCI+RES）。实验内容：1、采取BME—403von Frey细丝法测定各组大鼠的机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)，同时采取BME-410C型全自动热痛刺激仪测定各组大鼠的热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)。2、运用原位杂交和逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术测定各组大鼠L4-5段背根神经节P2X_3和P2X_7受体mRNA的表达情况。3、运用免疫荧光双标观察各组细胞中P2X_7受体的表达情况，以及大鼠DRG胶质细胞P2X_7受体和神经元P2X_3受体的表达情况。4、采取免疫组织化学染色法和蛋白印迹检测各组大鼠L4-L5背根神经节（DRG）中的P2X_3和P2X_7受体蛋白的表达情况,以及蛋白印迹检测p38和ERK1/2的磷酸化程度。5、运用酶联免疫吸附实验（Epsa）检测各组大鼠血清中IL-6和TNF-α的含量。结果：1、术后5-7天，CCI模型组和CCI+RES组大鼠手术侧后肢的MWT和TWL显著低于Ctrl+NS、Ctrl+RES、Sham组，且有显著性作用(p0.01)，表明造模成功。而Ctrl+NS、Ctrl+RES、Sham这三组相比较没论文导读：著升高(p0.01)；而CCI+RES组显著低于CCI模型组(p0.01)。3、免疫荧光双标结果表明：LPS能够增加卫星胶质细胞P2X_7受体的表达，同时，白藜芦醇能够抑制此增强作用，除此之外CCI模型组大鼠DRG胶质细胞P2X_7受体的表达显著高于Ctrl+NS组、Ctrl+RES组、Sham组，且DRG神经元细胞P2X_3受体的表达也显著高于Ctrl+NS组、Ctrl+RES组、Sham组
有显著性差别(p0.05)；术后7-14d，CCI+RES组的MWT和TWL较CCI组显著升高，有显著性差别(p0.01)，并接近于Ctrl+NS组；2、术后14d，原位杂交、RT-PCR实验结果表明：与Ctrl+NS组、Ctrl+RES组、Sham组这三组相比，CCI模型组L4-L5段背根神经节P2X_3以及P2X_7受体mRNA的表达显著升高(p0.01)；而CCI+RES组显著低于CCI模型组(p0.01)。3、免疫荧光双标结果表明：LPS能够增加卫星胶质细胞P2X_7受体的表达，同时，白藜芦醇能够抑制此增强作用，除此之外CCI模型组大鼠DRG胶质细胞P2X_7受体的表达显著高于Ctrl+NS组、Ctrl+RES组、Sham组，且DRG神经元细胞P2X_3受体的表达也显著高于Ctrl+NS组、Ctrl+RES组、Sham组。4、免疫组化、蛋白印迹结果表明：CCI模型组大鼠L4-L5段背根神经节P2X_3和P2X_7受体蛋白的表达较Ctrl+NS组、Ctrl+RES组、Sham组显著升高(p0.01)；而CCI+RES组显著低于CCI模型组(p0.01)。5、Epsa结果表明，CCI模型组大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量较Ctrl+NS组、Ctrl+RES组、Sham组显著增加(p0.01)，而CCI+RES组血清中TNF-α和IL-6的含量较CCI大鼠模型组低(p0.01)。6、蛋白印迹结果表明，CCI模型组大鼠L4-L5段背根神经节p38和ERK1/2的磷酸化程度显著高于Ctrl+NS组、Ctrl+RES组、Sham组(p0.01)，而CCI+RES组背根神经节p38和ERK1/2的磷酸化程度显著低于CCI模型组(p0.05)。结论：白藜芦醇对背根神经节P2X_3和P2X_7受体介导的神经病理性疼痛具有抑制作用。关键词：P2X_3受体论文P2X_7受体论文白藜芦醇论文背根神经节论文神经病理痛论文
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ABSTRACT5-12
第1章 引言12-15
第2章 材料与策略15-29

2.1 材料15-21

2.

1.1 实验动物15

2.1.2 主要试论文导读：蛋白印迹40-413.6.3ERK1/2蛋白印迹41-433.6.4p38MAPK蛋白印迹43-453.7Epsa45-47第4章讨论47-50第5章结论50-51致谢51-52参考文献52-57攻读学位期间的探讨成果57-58综述58-68参考文献65-68附件68上一页123
剂15-17
2.

1.3 主要仪器17

2.

1.4 溶液配制17-21

2.2 策略21-29

2.1 原代卫星胶质细胞的培养21

2.2 细胞处理以及实验动物分组21

2.3 建立慢性神经病理性疼痛模型21-22

2.4 灌胃给药22

2.5 神经病理痛大鼠行为学检测22

2.6 原位杂交22-23

2.7 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）23-24

2.8 免疫组织化学染色策略24-25

2.9 细胞免疫荧光双标25

2.10 免疫组织荧光双标25-26

2.11 蛋白印迹（Western Blot）26-27

2.12 酶联免疫吸附实验（Epsa）检测策略27-28

2.13 统计学策略28-29

第3章 结果29-47

3.1 行为学结果29-30

3.

1.1 机械缩足反射阈值（MWT）测定结果29-30

3.

1.2 热缩足反射潜伏期(TWL)测定结果30

3.2 原位杂交30-32
3.

2.1 P2X_3原位杂交30-31

3.

2.2 P2X_7原位杂交31-32

3.3 RT-PCR32-35

3.1 P2X_3RT-PCR32-34

3.2 P2X_7RT-PCR34-35

3.4 免疫组织化学35-36

3.4.1 P2X_3免疫组化35

3.4.2 P2X_7免疫组化35-36

3.5 免疫荧光36-39

3.5.1 P2X_7免疫细胞化学36-37

3.5.2 P2X_7免疫组织荧光双标37-38

3.5.3 P2X_3免疫组织荧光双标38-39

3.6 蛋白印迹39-45

3.6.1 P2X_3蛋白印迹39-40

3.6.2 P2X_7蛋白印迹40-41

3.6.3 ERK1/2 蛋白印迹41-43

3.6.4 p38 MAPK 蛋白印迹43-45

3.7 Epsa45-47

第4章 讨论47-50
第5章 结论50-51
致谢51-52
参考文献52-57
攻读学位期间的探讨成果57-58
综述58-68
参考文献65-68
附件68