谈述鼻咽癌鼻咽癌miRNA组学动态表达特点及miR-18a通过Dicer1介导致癌机制学位

论文导读：I中鼻咽癌cDNA数据库(GEO:GSE12452)数据整合,得到以Smad2等为代表的差别miRNAs组的靶基因,并通过real-timePCR验证部分(?)niRNAs和靶基因在不同临床分期的鼻咽癌组织标本和对照样本中的表达。通过GO和pathway浅析,上调差别miRNAs组的靶基因GO功能主要集中在粘附、凋亡和细胞死亡；下调差别miRNAs组的靶基因GO功能主要集中在
摘要：MicroRNAs (miRNAs,小非编码RNA)能够与下游靶基因mRNA的3’UTR碱基配对并引导沉默复合物(RISC)降解mRNA或抑制：mRNA的翻译,参与生物合成和肿瘤的进展,其生物学功能机制是目前探讨的热点领域之一。miRNA组学(microRNomics)属于基因组学的分支,包括miRNAs差别筛选、动态表达、分子结构、表达调控、靶基因预测及生物学功能浅析等探讨。鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)发生、进展及转移是一个多步骤多因素参与的复杂历程。迄今为止,对鼻咽癌组织进行niRNA分子差别表达谱浅析的探讨也是十分有限。在本论文中,我们旨在阐明鼻咽癌不同临床阶段的miRNA组学时空变化走势以及miR-18a调控miRNAs组学作用的探讨机制。[鼻咽癌不同临床阶段miRNA组学动态表达规律]利用显微切割分离纯化不同临床阶段的鼻咽癌组织标本和对照鼻咽上皮标本,采取illumina的miRNA芯片浅析,MultiClassDif统计软件筛选出48个miRNAs分子在鼻咽癌不同临床阶段组学中表达有着差别。进一步运用生物学软件cluster3.0软件,将差别miRNA组的表达分为6种动态方式：其中3类差别miRNA组的方式归纳为不同的下降方式；另外3类差别miRNA组是不同的上升方式。进而运用targetScan软件,浅析并预测差别miRNAs组靶基因,用数据库ftp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/UniGene/组织特异性筛选差别miRNA组靶基因。然后与NCBI中鼻咽癌cDNA数据库(GEO: GSE12452)数据整合,得到以Smad2等为代表的差别miRNAs组的靶基因,并通过real-time PCR验证部分(?)niRNAs和靶基因在不同临床分期的鼻咽癌组织标本和对照样本中的表达。通过GO和pathway浅析,上调差别miRNAs组的靶基因GO功能主要集中在粘附、凋亡和细胞死亡；下调差别miRNAs组的靶基因GO功能主要集中在细胞增殖、死亡和凋亡；上调差别miRNAs组的靶基因pathway主要集中在Adherens junction、Focal adhesion等与肿瘤转移相关的pathway,而下调差别miRNAs组的靶基因pathway主要集中在Pathways in cancer等。利用miRNAs与靶基因的负相关性,绘制了差别miRNAs组与靶基因的niRNAs-Genes网络图。miRNAs调控除了直接受Dicerl和Drosha的作用外,还受到转录因子的调控,由此,我们利用UCSC寻找差别miRNAs编码基因在基因组上的位置,确定ETS2等转录因子在调控miRNAs编码基因表达发挥循环反馈调控作用；并绘制差别miRNAs和转录因子的调控网络联系。为鼻咽癌发生、进展的分子机制探讨提供新的思路。[MiR-18a具有推动鼻咽癌增殖、迁移和侵袭转移功能]MiRNA芯片筛选发现(?)niR-18a在鼻咽癌不同临床分期及淋巴结转移癌中有着显著差别。利用real-time PCR证实miR-18a随着临床分期进展而表达逐渐增加,并且在鼻咽癌细胞中高表达,原位杂交结果显示miR-18a与鼻咽癌的临床分期、淋巴结转移、EBV感染以及预后相关。MTT、伤口愈合实验以及transwell基质胶侵袭实验证明miR-18a过表达分别能够推动鼻咽癌细胞HK1、5-8F和6-10B的增殖、迁移能力和侵袭转移能力；反之抑制miR-18a则减少或降低鼻咽癌细胞的增殖、迁移能力和侵袭转移能力。采取慢病毒系统构建miR-18a的过表达和knockdown的稳定鼻咽癌HKl细胞系并通过real-time PCR验证。采取活体荧光示踪技术模拟miR-18a在裸鼠体内的推动鼻咽癌增殖和转移模型,揭示miR-18a能够推动裸鼠体内皮下移植瘤的增殖,miR-18a能够推动鼻咽癌细胞在裸鼠体内转移能力。[MiR-18a通过Dicerl推动鼻咽癌进展的致癌机制]通过targetScan等软件预测、以及荧光素酶报告基因实验证明Dicerl是miR-18a的靶基因,并采取real-time和western验证miR-18a能降低内源性Dicerl的表达。通过miRNA芯片miRNA Dicerl检测发现miR-18a能够下调78%的其他表达,恢复则逆转80%的miRNA的表达。其中miR-18a下调miR-143和miR-200家族表达最为显著。通过niR-18a处理Dicer1的过表达和knockdown的细胞,以正反两面证实miR-18a作为一个癌基因通过Dicer1发挥生物学功能。real-time PCR和western验证miR-18a可以调控miR-200家族及EMT标志物分子的变化；另外验证miR-18a通过Dicer1调控miR-143及靶基因K-Ras的表达,推动鼻咽癌的进展。综上所述,我们通过miRNA芯片筛选到一组与不同临床分期进展及淋巴转移可能起关键作用的miRNAs,揭示了鼻咽癌不同临床阶段的差别miRNAs组学变化走势,通过与网络GEO数据整合,阐述了鼻咽癌差别miRNAs的靶基因的GO和pathway浅析,进一步浅析差别miRNAs表达调控的因素,利用USCS数据寻找调控差别miRNAs组学的转录因子以及他们之间的反馈调控联系。阐述了miR-18a能够推动鼻咽癌细胞的增殖,侵袭转移功能及推动裸鼠体内的成瘤速度和转移转移能力。揭示niR-18a通过Dicerl调节miRNAs组学的表达,通过生物学功能实验证明miR-18a通过Dicer1推动鼻咽癌的发生进展。阐述了miR-18a与niR-200家族和miR-143以及其他miRNAs之间的联系,揭示了miR-18a与Dicerl在鼻咽癌的临床分期、淋巴结转移、EBV感染以及预后的相关性。关键词：MicroRNAs(miRNAs)论文miRNAs组学论文论文导读：-271.6引物27-301.7主要仪器30-322策略32-512.1鼻咽癌标本及对照标本采集322.2显微切割纯化鼻咽癌组织标本322.3RNA的提取32-342.4miRNA芯片342.5miRNA芯片数据浅析34-362.6实时定量PCR(Real-timePCR)验证36-382.7miRNA瞬时转染目的细胞38-392.8质粒构建及细菌克隆39-432.9细胞生物学实验43-442.10免疫组化、免
鼻咽癌论文miR-18a论文Dicer1论文
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ABSTRACT9-16
主要縮略词简表16-23
第二章 材料与策略23-51

1. 材料23-32

1.1 组织和细胞系样本23-24

1.2 实验动物24

1.3 菌株和质粒载体24

1.4 Human MicroRNA芯片24

1.5 试剂24-27

1.6 引物27-30

1.7 主要仪器30-32

2 策略32-51

2.1 鼻咽癌标本及对照标本采集32

2.2 显微切割纯化鼻咽癌组织标本32

2.3 RNA的提取32-34

2.4 miRNA芯片34

2.5 miRNA芯片数据浅析34-36

2.6 实时定量PCR(Real-time PCR)验证36-38

2.7 miRNA瞬时转染目的细胞38-39

2.8 质粒构建及细菌克隆39-43

2.9 细胞生物学实验43-44

2.10 免疫组化、免疫荧光检测和原位杂交检测44-47

2.11 Luciferrase检测miRNA靶基因47

2.12 Western Blot47-49

2.13 裸鼠动物试验49-50

2.14 统计学浅析50-51

第三章 结果51-121
第一部分：鼻咽癌不同临床阶段MIRNA组学动态表达规律51-75

1.1 鼻咽癌组织标本和对照上皮组织的收集51-53

1.2 鼻咽癌组织标本显微切割53-54

1.3 鼻咽癌不同临床分期及转移淋巴癌的miRNA芯片筛选54-61

1.4 鼻咽癌差别miRNA演进的动态表达方式61-63

1.5 差别miRNA的靶基因筛选63-66

1.6 差别miRNA的靶基因的GO及pathway浅析66-69

1.7 差别表达miRNAs与靶基因的miRNAs-Genes调控网络69-71

1.8 差别miRNA的表达调控因素浅析71-75

第二部分：MIR-18A生物学功能探讨75-99

2.1 鼻咽癌miRNA芯片中大部分miRNA下调走势75-79

2.2 miR-18a在不同阶段的鼻咽癌中的表达以及与临床预后的相关性79-83

2.3 miR-18a推动鼻咽细胞的增殖、侵袭以及转移能力83-88

2.4 miR-18a过表达和knockdown的稳定细胞株构建88-94

2.5 miR-18a推动动物体内鼻咽癌的细胞的增殖和转移94-99

第三部分：MIR-18A通过DICER1介导的鼻咽癌的致病机制99-121

3.1 miR-18a靶向调节Dicer1的表达99-102

3.2 miR-18a通过Dicer1调节miRNA的表达合成102-104

3.3 miR-18a通过Dicer1影响其生物学效应104-118

3.4 miR-18a与Dicer1表达的相关性浅析118-121

第四章 讨论121-133
结论133-134
参考文献134-147
综述147-160
参考文献156-160
致谢160-161
探讨成果161-162