阐述蟾蜍中华蟾蜍与日本蟾蜍皮肤galectin-3cDNA克隆、序列及原核表达

论文导读：RNA的提取302.3.3中华蟾蜍皮肤galectin-CR扩增结果30-312.3.4重组质粒的鉴定31-332.3.5测序结果33-342.4讨论34-362.4.1蟾蜍组织的选择34-352.4.2EcoRⅠ的双酶切352.4.3ORF浅析35-36第三章中华蟾蜍galectin-3序列的生物信息学浅析36-553.1材料36-373.

1.1序列来源36-373.2策略373.3结果与浅析37-493.3.

摘要：galectin-3作为多功能的β-半乳糖结合蛋白，其抑制剂被认为是一种新型的抗肿瘤药物。其中，由108-250位氨基酸组成的N末端截短型人galectin-3(galectin-3C)因抗肿瘤效果良好且无毒副作用，被考虑作为相对安全可靠的抗癌药物，但需作更进一步的探讨。本探讨选用中华蟾蜍与日本蟾蜍皮肤为探讨对象，克隆并浅析了两者galectin-3基因的cDNA序列，构建的原核表达重组质粒为进一步探讨galectin-3C生物学功能及其运用奠定了基础。具体结论如下：1、以日本蟾蜍皮肤cDNA质粒文库为模板筛选出5条galectin-3全长cDNA序列(登录号为JQ765589-JQ765593)，随后以中华蟾蜍皮肤总RNA反转录第一链cDNA为模板，克隆galectin-3ORF序列至pGM-T载体，测序后确认获得9个cDNA克隆(X1-2登陆号为AEX58672.1)。其中3条(3/14)序列为N末端缺失突变体。2、利用生物信息学软件进行序列浅析，结果表明：①同一个体的蟾蜍皮肤galectin-3cDNA呈现序列多态性，中华蟾蜍galectin-3C区域具有高密度的单核苷酸多态性(SNP)，每20bp出现1个SNP。推测该多态性可能有益于蟾蜍个体应对复杂多变的环境，增强其对环境的适应能力；②预测中华蟾蜍galectin-3蛋白在Ser6、Ser186有潜在的丝氨酸磷酸化位点，N末端缺乏信号肽和跨膜结构域，主要定位于胞核、细胞质，属于胞内蛋白。中华蟾蜍galectin-3具有与人类同源蛋白相似的结构特点；③依据与一些哺乳动物的galectin-3具有相同的磷酸化位点、糖基结合位点和相关基序，预测中华蟾蜍galectin-3具有Ser6磷酸化与CRD糖基结合功能。3.根据生物信息学浅析结果设计引物，利用pET-28b(+)载体构建三种不同长度galectin-3C的原核表达重组质粒，优化重组蛋白诱导表达条件。关键词：中华蟾蜍论文日本蟾蜍论文半乳糖凝集素-3论文基因克隆论文生物信息学浅析论文原核表达论文
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ABSTRACT5-10
前言10-11
第一章 文献综述11-22

1.1 凝集素概述11-12

1.1 命名11-12

1.2 分类12

1.2 galectin-312-17

1.2.1 galectin-3 的基因、蛋白结构13-14

1.2.2 galectin-3 的组织分布与表达14-15

1.2.3 galectin-3 糖基结合位点浅析15-16

1.2.4 galectin-3 的磷酸化16-17

1.3 galectin-3 与肿瘤17-20

1.3.1 galectin-3 在肿瘤细胞凋亡中的作用17-19

1.3.1 细胞内 galectin-3 的抗凋亡作用17-18

1.3.2 细胞外 galectin-3 的抗凋亡作用18

1.3.3 细胞外 galectin-3 的促凋亡作用18-19

1.3.2 galectin-3 在肿瘤细胞转移中的作用19-20

1.4 galectin-3C 的探讨进展20-22

1.4.1 galectin-3 抑制剂20-21

1.4.2 galectin-3C 的探讨进展21-22

第二章 蟾蜍 galectin-3 基因全长 ORF 的克隆、鉴定22-36

2.1 材料22-25

2.

1.1 试验动物22

2.

1.2 大肠埃希菌菌株与 cDNA 质粒文库22

2.

1.3 质粒22-23

2.

1.4 培养基及抗生素23-24

2.

1.5 主要试剂的配制24

2.

1.6 工具酶及其他试剂24

2.

1.7 主要实验仪器24-25

2.2 策略25-30

2.1 日本蟾蜍 galectin-3 克隆25-26

2.2.

1.1 日本蟾蜍皮肤 cDNA 质粒文库转化25

2.2.

1.2 全长 cDNA 筛选25

2.2.

1.3 质粒回收25-26

2.2.

1.4 DNA 限制性内切酶消化26

2.2.

1.5 DNA 测序26

2.2.2 中华蟾蜍 galectin-3 克隆26-30

2.1 皮肤总 RNA 的提取26-27

2.2 总 RNA 提取质量检测27

2.3 引物设计27

2.4 反转录反应合成第 链 cDNA27-28

2.5 目的 cDNA 的扩增与电泳28

2.6 PCR 产物与 T-Vector 的连接28

2.7 大肠埃希菌(E.cop DH5α)感受态细胞的制备28-29

2.8 连接产物转化29

2.9 菌 PCR29

2.10 质粒回收与双酶切鉴定29

2.11 DNA 测序29-30

2.3 结果与浅析30-34

2.3.1 日本蟾蜍皮肤 cDNA 质粒文库盲筛结果30

2.3.2 中华蟾蜍皮肤总 RNA 的提取30

2.3.3 中华蟾蜍皮肤 galectin-3 PCR 扩增结果30-31

2.3.4 重组质粒的鉴定31-33

2.3.5 测序结果33-34

2.4 讨论34-36

2.4.1 蟾蜍组织的选择34-35

2.4.2 EcoRⅠ的双酶切35

2.4.3 ORF 浅析35-36

第三章 中华蟾蜍 galectin-3 序列的生物信息学浅析36-55

3.1 材料36-37

3.

1.1 序列来源36-37

2 策略37

3.3 结果与浅析37-49

3.1 中华蟾蜍 galectin-3 核苷酸多样性浅析37-39

3.2 日本蟾蜍 galectin-3 分子多样性浅析39-41

3.3 galectin-3 氨基酸位点突变41-43

3.4 galectin-3 编码蛋白一级结构序列浅析43

3.5 蛋白质的同源性检索及系统发生进化树浅析43-45

3.3.6 galectin-论文导读：在大肠埃希菌中的表达655.3.2诱导时间对重组质粒表达的影响65-675.4讨论67-68第六章结论与展望68-706.1结论686.2展望68-70参考文献70-79附录79-90附录一：缩写词英汉对照79-82附录二：ORFFinder浅析结果82-90作者介绍90-91致谢91上一页12
3 蛋白质的二级结构预测45-46

3.7 galectin-3 蛋白质的立体结构预测46

3.8 galectin-3 蛋白质的功能结构域浅析46-49

3.8.1 保守结构域预测46-47

3.8.2 酸化位点预测47

3.8.3 亚细胞定位预测47-48

3.8.4 信号肽预测48-49

3.8.5 跨膜结构浅析49

3.4 讨论49-55

3.4.1 galectin-3 N 末端缺失突变体与 galectin-3 抑制剂开发49-50

3.4.2 蟾蜍皮肤 galectin-3 序列多态性的真实性50

3.4.3 蟾蜍皮肤 galectin-3 序列多态性的分子形成机制50-51

3.4.4 蟾蜍皮肤 galectin-3 序列多态性的生物学适应作用51

3.4.5 蟾蜍皮肤 galectin-3 分子多样性与中性学说51-52

3.4.6 蟾蜍皮肤 galectin-3 的结构与功能预测52-55

第四章 中华蟾蜍 galectin-3 基因及其 3 种 galectin-3 C 基因的亚克隆与原核表达载体构建55-63

4.1 材料55-57

4.

1.1 质粒55-56

4.

1.2 大肠埃希菌菌株56

4.

1.3 培养基及抗生素56

4.

1.4 主要试剂的配制56

4.

1.5 工具酶及其他试剂56

4.

1.6 主要实验仪器56-57

4.2 策略57-60
4.

2.1 galectin-3C 序列的设计57

4.

2.2 引物设计57-58

4.

2.3 galectin-3 与 galectin-3C 的亚克隆58

4.

2.4 PCR 产物纯化58

4.

2.5 双酶切58-59

4.

2.6 酶切产物凝胶回收及纯化59

4.

2.7 表达载体 pET-28b 的制备59

4.

2.7.1 pET-28b 质粒的提取59

4.

2.7.2 表达载体线性化59

4.

2.8 表达载体的构建和鉴定59-60

4.

2.8.1 连接59-60

4.

2.8.2 转化60

4.

2.8.3 菌落 PCR 鉴定60

4.

2.8.4 质粒回收双酶切鉴定60

4.

2.9 序列测定60

4.3 结果与浅析60-62
4.

3.1 PCR 纯化结果60

4.

3.2 目的片段与载体酶切后结果60-61

4.

3.3 表达载体的菌落 PCR 鉴定和双酶切鉴定61-62

4.

3.4 DNA 测序62

4.4 讨论62-63

4.1 原核表达载体的选用62

4.2 原核表达载体的构建62-63

第五章 原核诱导表达条件优化63-68

5.1 材料63-64

5.

1.1 培养基及抗生素63

5.

1.2 大肠埃希菌菌株及其他试剂63

5.

1.3 主要试剂的配制63-64

5.

1.4 主要实验仪器64

5.2 策略64-65
5.

2.1 重组质粒转化64

5.

2.2 重组蛋白的诱导表达及其条件优化64

5.

2.3 SDS-PAGE 电泳及染色64-65

5.3 结果与浅析65-67
5.

3.1 重组质粒在大肠埃希菌中的表达65

5.

3.2 诱导时间对重组质粒表达的影响65-67

5.4 讨论67-68
第六章 结论与展望68-70

6.1 结论68

6.2 展望68-70

参考文献70-79
附录79-90
附录一：缩写词英汉对照79-82
附录二：ORF Finder 浅析结果82-90
作者介绍90-91
致谢91