探讨克隆池蝶蚌铁蛋白基因特点与表达

论文导读：铁蛋白基因表达浅析50-523.2.6嗜水气单胞菌诱导池蝶蚌性腺组织中铁蛋白基因表达浅析52-553.2.7嗜水气单胞菌诱导池蝶蚌血细胞中铁蛋白基因表达浅析55-573.3讨论57-60第四章池蝶蚌铁蛋白两个亚基基因的原核表达及多克隆抗体制备60-804.1材料与策略60-704.

1.1质粒与菌株604.2引物设计60-614.3重组表达载体的构建61

摘要：池蝶蚌(Hyriopsis schlegepi)原产于日本滋贺县琵琶湖,属软体动物门、瓣鳃纲、蚌科、帆蚌属,是一种优质的淡水育珠蚌。本探讨以池蝶蚌中克隆得到两个铁蛋白亚基基因(HsFer-1和HsFer-2),荧光定量PCR技术浅析了ferritin mRNA组织表达谱及在细菌诱导下主要组织中ferritin表达特点,原核表达重组蛋白,制备多克隆抗体。1.以本实验室构建的嗜水气单胞菌诱导的池蝶蚌血细胞cDNA文库中获得编码ferritin的两条EST,运用ART RACE策略克隆得到HsFer-1和HsFer-2基因的cDNA全长。序列信息已提交至NCBI,GenBank登录号分别为HQ841015和HQ841016。2. Real-time PCR结果显示HsFer-1和HsFer-2mRNA在肝胰腺、性腺、斧足、肠、肾、心脏、鳃、闭壳肌、外套膜和血细胞中均有表达,在肝胰腺中表达量最高,其次为性腺、斧足和肠,在血细胞中表达量最低。3.用嗜水气单胞菌诱导池蝶蚌,Real-time PCR结果显示细菌诱导显著上调HsFer-1基因mRNA在肝胰腺、性腺和血细胞中的表达,其最高表达水平分别是对照组的2.47倍、9.59倍和1.37倍。诱导后,HsFer-2基因mRNA表达量在性腺中升高到4.87倍,而在肝胰腺和血细胞中分别下降至0.52倍和0.57倍。4.构建pET-32a-HsFer-1和pET-32a-HsFer-2重组表达质粒,原核表达重组蛋白,制备多克隆抗体。Western blot结果显示本探讨成功获得anti-HsFer-1和anti-HsFer-2的多克隆抗体。关键词：池蝶蚌论文铁蛋白论文基因克隆论文荧光定量PCR论文多克隆抗体论文
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ABSTRACT4-11
第一章 文献综述11-23

1.1 铁蛋白探讨概况11

1.2 铁蛋白的结构与特性11-13

1.3 铁蛋白的亚基组成及组织分布13-15

1.3.1 动物铁蛋白13-14

1.3.2 植物铁蛋白14

1.3.3 细菌铁蛋白14-15

1.4 铁蛋白基因的表达与调控15-16

1.5 铁蛋白的生物学功能16-19

1.5.1 调节铁代谢平衡16

1.5.2 抗氧化胁迫16-17

1.5.3 免疫防御17-18

1.5.4 参与机体生长发育18-19

1.6 铁蛋白探讨热点19

1.6.1 铁蛋白与疾病诊断19

1.6.2 铁蛋白与转基因19

1.7 铁蛋白在贝类中的探讨19-21

1.8 本探讨的内容、目的和作用21-23

第二章 池蝶蚌铁蛋白两个亚基基因cDNA全序列克隆23-41

2.1 材料与策略23-30

2.

1.1 实验材料23

2.

1.2 池蝶蚌血细胞总RNA的提取23-24

2.

1.3 RNA纯度与完整性检测24

2.

1.4 总RNA的DNase处理24-25

2.

1.5 ART cDNA的合成25

2.

1.6 池蝶蚌ferritin cDNA部分片段的获得25

2.

1.7 RACE-PCR策略克隆ferritin cDNA全长25-27

2.

1.8 PCR扩增产物的检测27

2.

1.9 目的片段的回收、克隆与测序27-29

2.

1.10 ferritin cDNA全长的序列拼接及序列浅析29-30

2.2 结果30-38

2.1 总RNA的提取30

2.2 文库筛选获得ferritin cDN段30-31

2.3 RACE-PCR扩增cDNA全长31-32

2.4 池蝶蚌HsFer-1和HsFer-2基因序列浅析32-38

2.3 讨论38-41

第三章 池蝶蚌铁蛋白基因的组织表达及嗜水气单胞菌诱导后的特异性表达41-60

3.1 实验材料和策略41-45

3.

1.1 实验材料41

3.

1.2 嗜水气单胞菌诱导菌液的制备41-42

3.

1.3 池蝶蚌HsFer-1和HsFer-2基因的组织表达谱浅析42-44

3.

1.4 嗜水气单胞菌诱导池蝶蚌铁蛋白表达浅析44-45

3.2 实验结果45-57
3.

2.1 总RNA提取45

3.

2.2 反转录效果检测45

3.

2.3 引物扩增效率的检测45-47

3.

2.4 池蝶蚌HsFer-1和HsFer-2基因的组织表达谱浅析47-50

3.

2.5 嗜水气单胞菌诱导池蝶蚌肝胰腺组织中铁蛋白基因表达浅析50-52

3.

2.6 嗜水气单胞菌诱导池蝶蚌性腺组织中铁蛋白基因表达浅析52-55

3.

2.7 嗜水气单胞菌诱导池蝶蚌血细胞中铁蛋白基因表达浅析55-57

3.3 讨论57-60
第四章 池蝶蚌铁蛋白两个亚基基因的原核表达及多克隆抗体制备60-80

4.1 材料与策略60-70

4.

1.1 质粒与菌株60

4.

1.2 引物设计60-61

4.

1.3 重组表达载体的构建61-65

4.

1.4 重组蛋白的表达及纯化65-67

4.

1.5 Bradford法测定纯化的融合蛋白浓度67

4.

1.6 多克隆抗体的制备67-68

4.

1.7 ELISA间接法测定多克隆抗体效价68-69

4.

1.8 Western blot检测抗体特异性69-70

4.2 实验结果70-78
4.

2.1 目的表达片段PCR扩增70-71

4.

2.2 阳性重组质粒的筛选71-72

4.

2.3 重组质粒双酶切72

4.

2.4 重组蛋白的诱导表达72-73

4.

2.5 融合蛋白溶解性浅析73-74

4.

2.6 重组蛋白的纯化74-75

4.

2.7 纯化蛋白浓度的测定75-76

4.

2.8 ELISA间接法测定多克隆抗血清效价76-77

4.

2.9 抗体特异性浅析77-78

4.3 讨论78-80
第五章 结论与展望80-82

5.1 结论80-81

5.2 进一步工作的方向81-82

致谢82-83
参考文献83-92
攻读学位期间的探讨成果92