阐述鸡传染性支气管炎病毒分离及N基因、S1基因序列-

论文导读：损失。为掌握该地区IB流行毒株的变异情况，探寻IB频发的理由，有效地运用疫苗防制IBV引起的疾病，本课题开展了对该地区鸡传染性支气管炎病原分离、病毒基因组中N基因和S1基因序列测定以及毒株间抗原相关性浅析的探讨。以疑似IB病鸡肺脏、支气管及肾脏等组织中成功地分离到两株病毒，通过鸡胚培养、HA试验、雏鸡接毒试验和RT-PCR
摘要：鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis，IB）是以鸡打喷嚏、咳嗽和气管啰音为主要症状的传染性呼吸道疾病，病原是鸡传染性支气管炎病毒（InfectiousBronchitis Virus，IBV）。近几年来，该病在某地鸡场时有发生，给当地养殖业造成了巨大的损失。为掌握该地区IB流行毒株的变异情况，探寻IB频发的理由，有效地运用疫苗防制IBV引起的疾病，本课题开展了对该地区鸡传染性支气管炎病原分离、病毒基因组中N基因和S1基因序列测定以及毒株间抗原相关性浅析的探讨。以疑似IB病鸡肺脏、支气管及肾脏等组织中成功地分离到两株病毒，通过鸡胚培养、HA试验、雏鸡接毒试验和RT-PCR鉴定等策略，证实该病毒为IBV，并分别命名为GY株和HQ株。参考GenBank中IBV毒株部分N基因和S1基因分别设计引物，扩增目的基因片段。通过测序浅析发现，GY株和HQ株N基因有着较为广泛的基因突变，还可能出现基因重组现象。其中GY株N基因及推导氨基酸同源性均与GX-YL1参考株最高，分别为97.2%和97.6%，且亲缘联系也最近；HQ株N基因及推导氨基酸与JH06111参考株同源性最高，分别为98.9%和98.5%，并且在遗传进化联系上与JH06111、GX-NN9、SC021201参考株同处一个较为独立的分支上；两个分离株N基因及推导氨基酸与疫苗株H120同源性均低于90.7%，而且亲缘联系较远。GY株和HQ株S1基因不仅有着大量的点突变，而且还出现了基因的插入现象。GY株S1基因及推导氨基酸同源性与CK/CH/LSD/091159参考株最高，分别为99.0%和98.5%，遗传进化联系上两者也较近；HQ株S1基因序列与CK/CH/Zhejiang/Quzhou3/0910参考株同源性高达99.6%，且它们亲缘联系也最近，HQ株S1基因推导氨基酸与XX09-3参考株同源性达99.1%，且亲缘联系最近；两个分离株S1基因及推导氨基酸与疫苗株H120同源性均低于77.5%，而且亲缘联系较远。运用气管环培养物将GY株、HQ株与疫苗株H120进行血清交叉中和试验，测得三者之间抗原相联系数（R）分别为0.4258、0.7034、0.4491，属同一血清型，但抗原相关性较低。探讨结果表明，该地区IBV流行毒株N基因、S1基因出现了较为广泛的基因突变，同时，毒株间的基因重组也可能是该地区IBV变异株产生的另一主要理由；IBV核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同源性和遗传进化联系、致病性、组织嗜性与血清型相互之间没有必定的联系。关键词：鸡传染性支气管炎病毒论文分离论文N基因论文S1基因论文中和试验论文
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Abstract10-12
第一章 综述12-21
1 国内外流行情况12
2 病原学12-14

2.1 分类地位12-13

2.2 形态特点13

2.3 理化特性13

2.4 血凝特性及干扰现象13-14

2.5 培养特性14

3 临床致病型14-15

3.1 呼吸型14

3.2 生殖道型14

3.3 肾型14

3.4 肠型14-15

3.5 腺胃型15

3.6 其他15

4 IBV 分子生物学探讨进展15-19

4.1 IBV 基因组结构15-16

4.2 IBV 编码蛋白及其生物学功能16-18

4.

2.1 N 蛋白16

4.

2.2 M 蛋白16-17

4.

2.3 S 蛋白17

4.

2.4 E 蛋白17

4.

2.5 非结构蛋白17-18

4.3 IBV 抗原位点18

4.4 IBV 遗传变异18-19

5 有着不足19
6 探讨作用19-21
第二章 材料和策略21-33
1 试验材料21-22

1.1 主要试剂21

1.2 主要试验仪器21-22

1.3 其他22

2 试验内容与策略22-33

2.1 病料的采取和处理22

2.2 病毒的分离22

2.3 血凝试验（HA）22-23

2.4 鸡胚接毒试验23

2.5 SPF 雏鸡攻毒试验23

2.6 RT-PCR 鉴定23-25

2.6.1 引物的设计与合成23

2.6.2 病毒 RNA 提取23-24

2.6.3 一步法 RT-PCR 扩增24-25

2.7 N 基因的克隆与序列测定25-29

2.7.1 引物设计与合成25

2.7.2 病毒 RNA 提取25

2.7.3 一步法 RT-PCR 扩增25-26

2.7.4 PCR 产物的纯化26

2.7.5 DH5α感受态细胞的制备26-27

2.7.6 pMD18-T 载体与纯化 PCR 产物的连接27

2.7.7 连接产物的转化27

2.7.8 重组质粒的提取27-28

2.7.9 重组质粒的 PCR 鉴定28-29

2.7.10 IBV N 基因序列测定与浅析29

2.8 S1 基因的克隆与序列测定29-31

2.8.1 引物设计29

2.8.2 病毒 RNA 提取29

2.8.3 一步法 RT-PCR 扩增29-30

2.8.4 PCR 产物的纯化30

2.8.5 DH5α感受态细胞的制备30

2.8.6 pMD18-T 载体与纯化 PCR 产物的连接30

2.8.7 连接产物的转化30

2.8.8 重组质粒的提取30

2.8.9 重组质粒的 PCR 鉴定30-31

2.8.10 IBV S1 基因序列测定与浅析31

2.9 血清交叉中和实验31-33

2.9.1 IBV 阳性血清制备31

2.9.2 气管环组织培养31

2.9.3 TOC-ID50的测定31-32

2.9.4 血清交叉中和试验32-33

第三章 试验结果33-51
1 病毒的分离与鸡胚接毒试验33
2 HA 试验33
3 SPF 雏鸡攻毒试验33-34
4 RT-PCR 鉴定结果34-35
5 N 基因的克隆35-36

5.1 N 基因 RT-PCR 扩增35

5.2 纯化的 PCR 产物电泳鉴定35

5.3 重组质粒的 PCR 鉴定35-36

6 S1 基因的克隆36-37论文导读：

6.1 RT-PCR 扩增36

6.2 纯化的 PCR 产物电泳鉴定36-37

6.3 重组质粒的 PCR 鉴定37

7 N 基因、S1 基因序列测定与浅析37-44

7.1 N 基因序列测定、同源性比较及进化树浅析37-39

7.2 N 基因推导氨基酸的序列浅析39-41

7.3 S1 基因序列测定、同源性比较及进化树浅析41-42

7.4 S1 基因推导氨基酸的序列浅析42-44

8 IBV 血清交叉中和试验结果44-51
8.1 TOC-ID50的测定44-46
8.

1.1 GY 株 TOC-ID50的测定与计算45-46

8.

1.2 HQ 株 TOC-ID50的测定与计算46

8.

1.3 H120 疫苗株 TOC-ID50的测定与计算46

8.2 血清交叉中和试验46-51
8.

2.1 GY 病毒与 GY 血清交叉中和试验结果47

8.

2.2 GY 病毒与 HQ 血清交叉中和试验结果47

8.

2.3 GY 病毒与 H120 血清交叉中和试验结果47-48

8.

2.4 HQ 病毒与 HQ 血清交叉中和试验结果48

8.

2.5 HQ 病毒与 GY 血清交叉中和试验结果48

8.

2.6 HQ 病毒与 H120 血清交叉中和试验结果48-49

8.

2.7 H120 病毒与 H120 血清交叉中和试验结果49

8.

2.8 H120 病毒与 GY 血清交叉中和试验结果49

8.

2.9 H120 病毒与 HQ 血清交叉中和试验结果49-50

8.

2.10 能保护 50%气管环的血清最高稀释倍数50

8.

2.11 分离株、疫苗株之间血清交叉中和相关性50-51

第四章 讨论51-54
1 病毒的分离与鸡胚接毒试验51
2 HA 试验51
3 序列测定与浅析51-53
4 血清交叉中和试验53-54
第五章 结论54-55
参考文献55-61
附录61-63
致谢63