研讨氧化应激诱导小鼠海马神经元microRNA表达谱转变及验证-要求

论文导读：RNA，NandropND-1000分光光度计测定RNA质量，1%琼脂糖凝胶电泳测定RNA纯度，采取AffymetrixmiRNA基因表达谱芯片GeneChipmiRNA2.0Array进行杂交，检测海马神经元miRNAs的表达谱。⑥miRNAs生物信息学浅析：根据基因芯片结果，筛选出倍数变化在1.5倍以上的miRNAs,运用DID软件对miRNAs的靶基因进行生物信息学浅析。⑦筛选与AD发病
摘要：目的：随着科技和经济的进展，现代社会人口老龄化走势迅速增加，老年性痴呆（Alzheimer’s Disease, AD）的患病率逐年上升，严重影响老年人的存活质量。AD是最常见的一种神经退行性疾病，以进行性认知功能障碍为特点，主要病理转变为皮质神经元数量减少、神经纤维缠结（neurofibrillary tangle, NFT）和含有β-淀粉样肽（β-amyloid peptide,Aβ）的老年斑（senile plaque, SP）的形成以及部分脑区（海马、新皮质和基底前脑等）神经突出消失等。AD的病因复杂，一般认为由基因突变、老化、外伤等多种因素引起，目前尚无有效的治疗策略，给个人、家庭和社会带来沉重的负担。关于AD的发病机制有着多种学说，包括氧化应激学说、基因突变学说、Aβ级联学说、Tau蛋白假说、线粒体功能障碍和自噬等，其中氧化应激学说备受关注。大量探讨证实氧化应激最早参与了AD的病理进程。MicroRNAs（miRNAs）是一类长度约22个核苷酸的内源性非编码小RNA，通过抑制mRNA的转录后翻译调控蛋白的表达。大量探讨表明，miRNAs在脑老化及神经退行性疾病的发生、进展历程中发挥重要作用。但在氧化应激致AD发病早期，miRNAs表达的转变及其对靶分子的调控机制尚不清楚。H2O2是一种稳定的活性氧自由基。本探讨以H2O2刺激原代培养的海马神经元制备氧化应激细胞模型，检测氧化应激诱导的miRNAs表达谱的转变。对差别性表达miRNAs进行Real-time PCR验证，并对其靶基因进行生物信息学浅析，筛选可能与氧化应激致AD发生有关的miRNAs。为进一步探讨miRNAs在AD发病中的作用和调控机制以及开发以miRNAs为靶点的相关药物提供依据。策略：（1）实验动物：封闭群清洁级健康快速老化模型小白鼠（SenescenceAccelerated Mouse, SAM）。（2）实验策略：①海马神经元分离培养：选择孕18-19天的SAMR1小鼠，取出完整的胎鼠海马组织进行分离培养，以5×108cells/L接种至直径35mm的培养皿中（2ml/dish），用于提取RNA进行基因芯片筛选及Real-time PCR验证；以5×107cells/L接种于96孔板中（200μl/孔），用于测定细胞活力；以1×108cells/L接种于24孔板中（1ml/孔），用于测定细胞凋亡、坏死。②海马神经元的鉴定：对生长到第7天的海马神经元进行特异性标志物微管相关蛋白2（Microtubule-associated protein2, MAP-2）免疫荧光染色，鉴定海马神经元。③MTT法测定细胞活力：将生长7天的海马神经元随机分为5组，每组中分别加入0、100μM、200μM、400μM、800μM的H_2O_2处理24h，用MTT法测定细胞活力，观察细胞损伤情况，选择合适的H_2O_2刺激浓度。④采取TUNEL和PI染色测定细胞凋亡、坏死：将生长了7天的海马神经细胞随机分为2组，其中一组加入正常neurobasel培养液，另一组加入含200μM H_2O_2的neurobasel培养液，24h后用TUNEL和PI染色法测定细胞凋亡、坏死。⑤提取细胞总RNA进行miRNAs基因芯片筛查：运用Qiagen公司的MiRNeasy Mini Kit试剂盒提取正常培养和200μMH_2O_2刺激6h后的海马神经元总RNA，Nandrop ND-1000分光光度计测定RNA质量，1%琼脂糖凝胶电泳测定RNA纯度，采取Affymetrix miRNA基因表达谱芯片GeneChip miRNA2.0Array进行杂交，检测海马神经元miRNAs的表达谱。⑥miRNAs生物信息学浅析：根据基因芯片结果，筛选出倍数变化在1.5倍以上的miRNAs,运用DID软件对miRNAs的靶基因进行生物信息学浅析。⑦筛选与AD发病有关的miRNAs采取Real-time PCR策略进行验证。⑧统计学策略：所有数据采取x±s表示。用SPSS13.0软件进行数据处理，采取方差浅析和独立样本t检验进行统计学浅析，以P 0.05为有统计学作用。结果：（1）海马神经元鉴定：微管相关蛋白MAP-2荧光染色，阳性反应物呈绿色荧光，反应物分布于神经元的胞体与树突，轴突和神经胶质细胞均不显色。染色结果显示，培养至第7天的海马神经元胞体饱满，呈椭圆形或多边形，树突发达，相互交错，形成发达的神经纤维网络。（2）细胞活力测定：MTT结果显示，不同浓度的H_2O_2刺激海马神经元，细胞活力显著降低（P 0.01），并且体现出剂量依赖性。（3）TUNEL染色测定细胞凋亡：与正常培养的海马神经元比较，200μM H_2O_2刺激24h后细胞凋亡显著增加（P 0.01）。（4）PI染色测定细胞坏死：与正常培养的海马神经元比较，200μM H_2O_2刺激24h后细胞坏死显著增加（P 0.01）。（5）miRNAs芯片结果：与正常对照组相比，H_2O_2刺激组有101个差别表达的miRNAs（P 0.05），其中17个变化在1.5倍之上。mmu-mir-26b、mmu-mir-296、hsa-mir-9-1、mmu-mir-369、hsa-mir-200c、mmu-mir-32、mmu-mir-1965、hsa-mir-708、mmu-mir-1190、hsa-mir-377、mmu-mir-135b、mmu-mir-201，12个miRNAs在H_2O_2刺激后的海马神经细胞表达显著上调；mmu-mir-470、mmu-mir-713、mmu-mir-297c、mmu-mir-190b、mmu-mir-291a，5个miRNAs在H_2O_2刺激后的海马神经细胞表达显著下调。（6）生物信息学浅析结果显示：这些差别性表达的miRNAs参与了细胞增殖、分化、凋亡、神经营养因子转运、信号传递、癌症生成等多个生物学历程，其中5个miRNAs（miR-708、miR-296、mi论文导读：活化蛋白激酶（Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）信号通路的激活。（7）差别性表达miRNAs的验证：综合考虑芯片结果、AD的病理变化及参考文献中miRNAs在海马组织中的表达量，筛选出miR-32、miR-196b、miR-26b、miR-708、miR-135b进行Real-timePCR验证。结果显示，miR-135b、miR-708在H_2O_2刺激组的表达量较正常组显著升高
R-200c、miR-377、miR-1190）的74个靶基因参与了丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路的激活。（7）差别性表达miRNAs的验证：综合考虑芯片结果、AD的病理变化及参考文献中miRNAs在海马组织中的表达量，筛选出miR-32、miR-196b、miR-26b、miR-708、miR-135b进行Real-time PCR验证。结果显示，miR-135b、miR-708在H_2O_2刺激组的表达量较正常组显著升高，与芯片结果一致。（8）对miR-135和miR-708进行GO浅析，结果显示：miR-135的靶基因主要参与了DNA重组、蛋白泛素化、蛋白磷酸化和转录因子结合等多种生物学历程的调控；miR-708的靶基因主要参与了小GTP酶活性、蛋白磷酸化、细胞增殖和神经元发育等历程的调控。结论：（1）H_2O_2刺激可引起神经元细胞活力显著下降、细胞凋亡与坏死显著增加，提示氧化应激引起细胞凋亡可能是AD发病的主要机制之一。（2）氧化应激可引起小鼠海马神经元miRNA表达谱的显著转变，提示差别性表达的miRNAs可能参与了氧化应激致AD发病的分子机制。（3）生物信息学浅析结果提示氧化应激状态下，miRNAs可能通过MAPK信号通路影响蛋白的泛素化和磷酸化，参与AD病理历程的形成。关键词：阿尔茨海默病论文microRNAs论文氧化应激论文生物信息学浅析论文凋亡论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。中文摘要4-7
英文摘要7-12
前言12-13
材料与策略13-20
结果20-23
附图23-29
附表29-35
讨论35-39
结论39-40
参考文献40-45
综述 MicroRNAs在老年性痴呆发病中的作用45-53
参考文献50-53
致谢53-54
个人简历54