探究小鼠脂肪干细胞分离培养及生物特性-

论文导读：
摘要：脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)是脂肪组织中有着的一种成体干细胞,具有便于取材,可向三个胚层方向分化等优点。本实验主要探讨ASCs的体外分离培养条件优化；ASCs向脂肪细胞、成骨细胞、精子细胞的诱导分化；Reversine对ASCs生物学特性的影响。通过MTT、免疫组化及RT-PCR证明,分离培养的ASCs在35代内保持良好的生物学特性,P5、P15、P25细胞倍增时间分别为34.6h、37.8h、38.3h；持续表达细胞表面抗原CD29、CD44,不表达造血干细胞特异表面抗原CD45；表达特异性基因CD29、CD34、CD90、Sca-1、c-Myc,不表达Sox-2和Oct-4。说明本实验采取的ASCs的分离培养策略能够保持ASCs的未分化状态。ASCs在成脂诱导剂诱导下分化为脂肪细胞,诱导第六天油红O染色计算P5ASCs诱导率为78.3%±9.2%,P15ASCs诱导率为73.9%±8.7%,P25ASCs诱导率为67.0%±1.52%,不同代数间诱导率无显著性差别；在成骨诱导剂诱导下分化为成骨细胞,第11天进行茜素红染色,钙结节被染成深红色,放大100倍视野下计数被染色的钙结节数量,P5ASCs为15±2.4个,P15ASCs为13±3.6个,不同代数之间无显著性差别；P5ASCs与睾丸组织共培养,10天后RT-PCR结果显示表达精子细胞特异基因Prml、Acr。Reversine终浓度大于5μmol/L时对ASCs有显著的细胞毒性,浓度为1μmol/L时,对ASCs的增殖率无显著影响,但可以显著增加ASCs向脂肪细胞,成骨细胞诱导分化的效率。本实验建立了ASCs分离培养系统,ASCs可以在此系统内长期培养并保持良好的生物学特性：证明了ASCs具有在适当诱导条件下向脂肪细胞、成骨细胞以及精子细胞分化的潜能；同时证明了reversine可以提升ASCs向脂肪细胞、成骨细胞分化的转分化率,是一种有效的提升ASCs分化潜能的小分子。关键词：脂肪干细胞论文分离培养论文成脂诱导论文成骨诱导论文精子诱导论文
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中文摘要6-7
ABSTRACT7-11
1 引言11-17

1.1 脂肪干细胞11-12

1.2 ASCs的分离培养与鉴定12-14

1.2.1 ASCs的分离培养12-13

1.2.2 ASCs的鉴定13-14

1.3 ASCs的生物学特性14-17

1.3.1 ASCs的自我更新能力14

1.3.2 ASCs的分化能力14-15

1.3.3 一种具有生物活性的小分子reversine15-17

2 实验材料17-21

2.1 细胞供体17

2.2 细胞培养所用主要培养基17

2.3 主要试剂和试剂盒17-18

2.4 主要实验仪器及耗材18-19

2.5 主要溶液的配制19-21

2.5.1 细胞培养所用培养基及主要溶液配制19-20

2.5.2 核酸电泳缓冲液的配制20-21

3 实验策略21-31

3.1 ASC的原代分离21

3.2 ASC的传代21-22

3.3 ASC的冻存22

3.4 ASC的复苏22

3.5 RT-PCR检测特定基因的表达22-25

3.5.1 以细胞中提取总RNA22-23

3.5.2 RNA的反转录23

3.5.3 PCR反应23-25

3.5.4 PCR产物的鉴定(1%琼脂糖凝胶电泳)25

3.6 免疫组化25-26

3.7 MTT法测定ASCs生长曲线26

3.8 ASCs的多向分化潜能26-31

3.8.1 诱导ASCs向脂肪细胞分化及鉴定26-27

3.8.2 诱导ASCs向成骨细胞分化及鉴定27-28

3.8.3 诱导ASCs向精子细胞分化及鉴定28-30

3.8.1 睾丸组织的分离培养28-29

3.8.2 ASCs与睾丸组织共培养29

3.8.3 睾丸组织条件培养液及RA共同作用诱导ASCs向精子细胞分化29-30

3.8.4 Reversine对ASCs生物学特性的影响30-31

3.8.4.1 MTT法测定reversine对ASCs细胞活性的影响30

3.8.4.2 RT-PCR检测不同浓度reversine对ASCs干性基因的影响.30

3.8.4.3 Reversine作用对ASCs分化潜能的影响30-31

4 结果31-51

4.1 ASC的分离、培养及鉴定31-41

4.

1.1 ASC的形态31-33

4.

1.2 ASCs的免疫组化鉴定33-40

4.

1.3 RT-PCR检测ASCs特异基因的表达40

4.

1.4 ASCs的生长曲线和倍增时间40-41

4.2 ASCs的多向分化潜能41-46
4.

2.1 将ASCs诱导为脂肪细胞41-43

4.

2.2 将ASCs诱导为成骨细胞43-45

4.

2.3 诱导ASCs向精子细胞分化45-46

4.3 Reversine对ASCs生物学特性的影响46-51
4.

3.1 reversine对ASCs活性的影响46-48

4.3.2 RT-PCR检测不同浓度reversine对ASCs干性基因的影响48-49
4.

3.3 Reversine对ASCs分化潜能的影响49-51

5 讨论51-54
6 结论54-55
参考文献55-59
作者简历59-61
学位论文数据集61