谈述斑马鱼bok基因在性腺发育中功能-

论文导读：
摘要：斑马鱼的繁殖力强、胚胎透明,是发育生物学、分子生物学和遗传学方面探讨中重要的方式生物。Bcl-2(B cell lymphoma/lewkmia-2)家族是决定真核细胞存活或凋亡的关键调控因子。bok (Bcl-2-related ovarian killer)是Bcl-2家族成员中的促凋亡成员,斑马鱼中含有bokl和bok2两种亚型。本探讨通过使斑马鱼bok基因在性腺中特异表达,以确定bok在性腺发育中的功能。本探讨以斑马鱼为实验材料,首先采取RT-PCR技术和荧光定量PCR技术检测bokl和bok2在斑马鱼不同组织器官、胚胎发育时期的表达方式。结果表明bokl除不能在斑马鱼的肝中表达在其他组织中均能检测到,如在眼、卵巢、精巢、脑、肠中表达量较高,在心、肾、脾也有表达；bok2在斑马鱼的卵巢、精巢、眼睛、肝中表达,且在眼睛和卵巢中表达量最高,而在其它的组织器官如脑、肠、心、脾、肾中均未检测到其表达。检测胚胎早期发育的不同时期,发现bokl在发育早期持续低水平低的表达；bok2以受精后即有较高水平的表达,一直持续到30%外包期,之后表达量降低,以90%外胞期表达量开始升高。荧光定量PCR检测。结果显示,未受精胚胎中bok2远高于bokl的表达。说明bok1、bok2都为母源性基因,除了在性腺中表达外还在其它组织中表达,推测这两个基因功能,除了影响性腺发育和配子发生,也对其它组织器官发育有作用。构建beta-actin-bokl-GFP-nanos和beta-actin-bok2-GFP-nanos重组质粒与tol2转座酶mRNA共同注射斑马鱼1细胞期受精卵,荧光显微镜观察发现得到除性腺特外其它组织也有绿色荧光的转基因鱼。得到P0代阳性转基因鱼,与野生鱼交配后得到转beta-actin-bok2-GFP-nanos的F1代饲养至性成熟,解剖F1现卵巢中较小的细胞有绿色荧光,而成熟的细胞没有荧光,并对卵巢进行冰冻切片观察,认为转基因鱼与野生鱼在在形态学上几乎没有差别。我们最后得到可育的转基因鱼,认为bok2的过表达对抑制性腺发育的作用不大。还需要进一步染色或凋亡浅析来确定过表达bok的转基因鱼的性腺是否发生异常凋亡,或者利用特异性的启动子使bok特异在性腺中表达,进而深入确定bok的功能。关键词：斑马鱼论文bok论文细胞凋亡论文表达方式论文转基因论文Real-Time论文PCR论文
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Abstract7-11

1. 前言11-22

1.1 转基因鱼的进展探讨11-13

1.1 转基因的进展探讨11-12

1.2 不育的探讨近况12-13

1.2 鱼类性腺发育13-15

1.2.1 斑马鱼性腺的发育13

1.2.2 鱼类生殖细胞的基本特点及其探讨13-14

1.2.3 鱼类PGCs的迁移14

1.2.4 nanos14-15

1.3 细胞凋亡15-18

1.3.1 细胞凋亡探讨进展16

1.3.2 细胞凋亡机制16-18

1.4 Bcl-2家族18-21

1.4.1 Bcl-2家族分类18

1.4.2 Bcl-2家族成员的生物学特性18-21

1.5 bok基因的探讨进展21

1.6 本探讨的目的和作用21-22

2. 材料与策略22-31

2.1 实验材料和引物序列22-23

2.2 主要仪器设备23

2.3 主要试剂23-24

2.4 实验策略24-31

2.4.1 实验材料的获取24

2.4.2 提取RNA并反转出cDNA第一条链24-25

2.4.3 制备感受态细胞25

2.4.4 bok1和bok2基因的克隆25-27

2.4.5 转化及筛选27

2.4.6 actin-bok1-GFP-nanos和actin-bok2-GFP-nanos融合载体的构建27-28

2.4.7 体外转录tol2的mRNA28-29

2.4.8 Real-Time PCR29

2.4.9 RT-PCR表达检测与浅析29-30

2.4.10 显微注射和转基因斑马鱼的检测30

2.4.11 冰冻切片30-31

3. 结果31-38

3.1 box1和box2的表达方式浅析31-33

3.

1.1 斑马鱼bok1和bok2在不同组织中的表达浅析31

3.

1.2 斑马鱼bok1和bok2在胚胎发育早期的表达浅析31-33

3.2 beta-actin-bok1-GFP-nanos和beta-actin-bok2-GFP-nanos载体构建与转基因鱼浅析33-38
3.2.1 beta-actin-bok1-GFP-nanos和beta-actin-bok2-GFP-nanos载体构建33-35
3.2.2 beta-actin-bok1-GFP-nanos和beta-actin-bok2-GFP-nanos载体转基因结果35
3.

2.3 解剖转基因鱼F1代卵巢并作冰冻切片35-38

4. 讨论38-40

4.1 bok1和bok2的表达方式浅析38

4.2 转actin-bok1-GFP-nanos和actin-bok2-GFP-nanos转基因鱼浅析38-40
参考文献40-50
在校期间论文发表情况50-51
致谢51