简论活性氧DBDCT致肝毒性蛋白质组学及Trxl介导氧化应激机制
最后更新时间：2024-03-05
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论文导读：
摘要：目的：建立[二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡](DBDCT)体内与体外的肝毒性模型，采取蛋白质组学技术分别对其意义前后蛋白质表达谱的转变进行分析及鉴定，通过对差别蛋白的验证极为功能分析，推测DBDCT引起肝毒性的主要意义机制。通过对由差别蛋白Trx1介导的氧化应激信号通路的探讨，研究DBDCT引起肝毒性的氧化应激意义机制极为毒性靶蛋白。办法：（1）SD大鼠腹腔注射DBDCT，并记录动物体重变化极为肝脏系数，分别检测血浆肝功生化指标，肝组织病理学变化从及锡的肝脏蓄积，从确定其对大鼠的肝脏毒性。（2）采取2-DE-TOF-TOF-MS分别对正常组和DBDCT染毒组大鼠肝脏膜蛋白和核蛋白表达谱进行分析，鉴定极为验证。（3）分别采取MTT法，透射电镜，比色法从及流式细胞术检测DBDCT对HL02肝细胞的抑制活性，细胞形态变化，胞外LDH含量，细胞凋亡、周期从及胞内ROS含量，初步研究DBDCT对HL02细胞的毒性意义极为机制。（4）采取2-DE-TOF-TOF-MS对DBDCT处理前后HL02细胞总蛋白表达谱进行分析，鉴定，并采取比色法、Western blot和RT-PCR办法对差别蛋白的功能极为表达进行验证。（5）采取Western blot和RT-PCR办法对差别蛋白Trx1，PARK7介导的氧化应激通路下游因子ASK1，JNK和P38进行检测；同时采取抗氧化剂乙酰-L-半胱氨酸(NAC)与DBDCT体外共同孵育，检测细胞生存率，ROS含量极为上面陈述的因子的蛋白变化水平。结果：（1）大鼠腹腔注射DBDCT2.3、3.2、4.5mg/kg后，动物体重逐渐增多，且随着给药次数的增多，动物出现不同程度的腹水现象，自发活动减少，嗜睡，高剂量组部分动物死亡；肝脏系数随着给药浓度的增多逐渐减少；DBDCT中高剂量染毒组AST，P和ACP水平显著升高，而ALT水平随着给药剂量的增多逐渐降低；病理切片可见DBDCT中剂量组有散发肝细胞嗜酸性变，核固缩，高剂量组被膜增生，部分肝细胞嗜酸性变，核固缩；原子吸收结果显示锡在大鼠肝脏形成一定的蓄积，且呈现显著的量效联系。（2）采取2-DE-TOF-TOF-MS共分析并鉴定出6个膜蛋白和10个核蛋白，包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(RGD1565368)，磷脂酰乙醇胺凝结蛋白(Pebp1)，醋酸盐水解酶1(Iah1)，S-腺苷甲硫氨酸合酶(Mat1a)，谷氨酸脱氢酶1(Glud1)，翻译起始因子5A-1(Eif5a)，腺苷酸激酶2(KAD2)，蛋白质二硫化物异构酶A3(PDIA3)，丁二酸脱氢酶(DHSA)，乙醛脱氢酶(ALDH2)，谷胱甘肽S-转移酶(GSTM2)，热休克蛋白(HS90B)，二甘氨酸脱氢酶(M2GD)，4-羟苯(基)丙酮酸双(加)氧酶(HPPD)，鸟氨酸转氨酶(OAT)。上面陈述的差别蛋白主要参与氧化还原/氧化应激，线粒体呼吸链电子传递，酶代谢从及氨基酸合成等生命历程。（3）体外肝毒性探讨结果显示DBDCT对HL02细胞的IC50值为5.77μM，且细胞固缩变圆，结构模糊，核膜破裂，胞外LDH水平显著升高。流式细胞术检测结果显示DBDCT染毒组细胞出现不同程度的凋亡与坏死，G2/M期发生阻滞，且胞内ROS含量逐渐升高。根据上面陈述的结果初步推测DBDCT的细胞肝毒性与细胞凋亡，周期阻滞极为氧化应激有关。（4）通过2-DE-TOF-TOF-MS对DBDCT意义前后HL02肝细胞总蛋白分析鉴定共得到9个差别蛋白，硫氧还蛋白(Trx1)，核苷酸结合蛋白(HINT1)，蛋白DJ1(PARK7)，细胞色素C氧化酶亚型5A(COX5A)，半乳糖凝集素-1(Gal-1)，过氧化物酶2(PRDX2)，过氧化物歧化酶(SODM)，3-羟酰辅酶A脱氢酶2(HCD2)，NADH脱氢酶(NDUS8)，且Western blot和RT-PCR对差别蛋白Trx1和PARK7的验证结果与2-DE结果一致。鉴定的差别蛋白主要参与细胞的氧化还原/氧化应激，线粒体相关功能，细胞凋亡、增殖与分化从及微管的调节等历程，其中氧化应激反应占据重要地位。（5）由Trx1介导的氧化应激通路探讨显示DBDCT干预细胞后，Trx1、DJ1、ASK1的蛋白表达和mRNA表达水平均升高， JNK和P38发生了蛋白磷酸化修饰，且呈现论文导读：
显著的时效与量效联系。N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)与DBDCT共同孵育细胞后，ROS表达水平显著下降，而细胞生存率上升，Trx1，DJ1蛋白的表达较DBDCT组降低，且JNK和P38的磷酸化水平也显著下降。其可能的意义机制为DBDCT诱导细胞自由基水平升高，使得Trx1蛋白表达升高从抵抗氧化应激意义，此时的Trx1逐渐失去了与ASK1的结合能力，使得ASK1游离；同时作为氧化应激的伴侣蛋白，DJ1也被激活并与死亡蛋白Daxx结合，进而抑制Daxx与ASK1的结合，使得游离的ASK1表达升高，激活MAPK通路中的JNK和P38，最终导致细胞凋亡与坏死。结论：（1）体内外探讨证明，DBDCT可引起显著的肝毒性。（2）氧化应激反应在毒性意义中占据重要地位，且主要通过升高胞内自由基水平，激活由Trx1介导的氧化应激通路来实现的。（3）抗氧化剂NAC可通过降低胞内ROS水平，进而影响Trx1介导的氧化应激通路从抵抗DBDCT引起的肝毒性。（4）Trx1蛋白可作为DBDCT引发肝毒性的早期监测指标。关键词：二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡（DBDCT）论文蛋白质组学论文氧化应激论文活性氧（ROS）论文硫氧还蛋白1(Trx1)论文N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)论文
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Abstract10-13
前言13-15
第一章 DBDCT 腹腔注射致大鼠肝脏毒性探讨15-38
第一节、DBDCT 腹腔注射致大鼠肝脏损伤模型的建立15-21
第一节 DBDCT 对 HL02 细胞的毒性意义探讨38-48
第一节 硫氧还蛋白 1（Trx1）介导的信号通路探讨61-67
参考文献74-83
英文缩略词83-85
综述85-97
参考文献92-97
攻读学位期间发表论文状况97-98
致谢98-99
个人介绍99-100
摘要：目的：建立[二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡](DBDCT)体内与体外的肝毒性模型，采取蛋白质组学技术分别对其意义前后蛋白质表达谱的转变进行分析及鉴定，通过对差别蛋白的验证极为功能分析，推测DBDCT引起肝毒性的主要意义机制。通过对由差别蛋白Trx1介导的氧化应激信号通路的探讨，研究DBDCT引起肝毒性的氧化应激意义机制极为毒性靶蛋白。办法：（1）SD大鼠腹腔注射DBDCT，并记录动物体重变化极为肝脏系数，分别检测血浆肝功生化指标，肝组织病理学变化从及锡的肝脏蓄积，从确定其对大鼠的肝脏毒性。（2）采取2-DE-TOF-TOF-MS分别对正常组和DBDCT染毒组大鼠肝脏膜蛋白和核蛋白表达谱进行分析，鉴定极为验证。（3）分别采取MTT法，透射电镜，比色法从及流式细胞术检测DBDCT对HL02肝细胞的抑制活性，细胞形态变化，胞外LDH含量，细胞凋亡、周期从及胞内ROS含量，初步研究DBDCT对HL02细胞的毒性意义极为机制。（4）采取2-DE-TOF-TOF-MS对DBDCT处理前后HL02细胞总蛋白表达谱进行分析，鉴定，并采取比色法、Western blot和RT-PCR办法对差别蛋白的功能极为表达进行验证。（5）采取Western blot和RT-PCR办法对差别蛋白Trx1，PARK7介导的氧化应激通路下游因子ASK1，JNK和P38进行检测；同时采取抗氧化剂乙酰-L-半胱氨酸(NAC)与DBDCT体外共同孵育，检测细胞生存率，ROS含量极为上面陈述的因子的蛋白变化水平。结果：（1）大鼠腹腔注射DBDCT2.3、3.2、4.5mg/kg后，动物体重逐渐增多，且随着给药次数的增多，动物出现不同程度的腹水现象，自发活动减少，嗜睡，高剂量组部分动物死亡；肝脏系数随着给药浓度的增多逐渐减少；DBDCT中高剂量染毒组AST，P和ACP水平显著升高，而ALT水平随着给药剂量的增多逐渐降低；病理切片可见DBDCT中剂量组有散发肝细胞嗜酸性变，核固缩，高剂量组被膜增生，部分肝细胞嗜酸性变，核固缩；原子吸收结果显示锡在大鼠肝脏形成一定的蓄积，且呈现显著的量效联系。（2）采取2-DE-TOF-TOF-MS共分析并鉴定出6个膜蛋白和10个核蛋白，包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(RGD1565368)，磷脂酰乙醇胺凝结蛋白(Pebp1)，醋酸盐水解酶1(Iah1)，S-腺苷甲硫氨酸合酶(Mat1a)，谷氨酸脱氢酶1(Glud1)，翻译起始因子5A-1(Eif5a)，腺苷酸激酶2(KAD2)，蛋白质二硫化物异构酶A3(PDIA3)，丁二酸脱氢酶(DHSA)，乙醛脱氢酶(ALDH2)，谷胱甘肽S-转移酶(GSTM2)，热休克蛋白(HS90B)，二甘氨酸脱氢酶(M2GD)，4-羟苯(基)丙酮酸双(加)氧酶(HPPD)，鸟氨酸转氨酶(OAT)。上面陈述的差别蛋白主要参与氧化还原/氧化应激，线粒体呼吸链电子传递，酶代谢从及氨基酸合成等生命历程。（3）体外肝毒性探讨结果显示DBDCT对HL02细胞的IC50值为5.77μM，且细胞固缩变圆，结构模糊，核膜破裂，胞外LDH水平显著升高。流式细胞术检测结果显示DBDCT染毒组细胞出现不同程度的凋亡与坏死，G2/M期发生阻滞，且胞内ROS含量逐渐升高。根据上面陈述的结果初步推测DBDCT的细胞肝毒性与细胞凋亡，周期阻滞极为氧化应激有关。（4）通过2-DE-TOF-TOF-MS对DBDCT意义前后HL02肝细胞总蛋白分析鉴定共得到9个差别蛋白，硫氧还蛋白(Trx1)，核苷酸结合蛋白(HINT1)，蛋白DJ1(PARK7)，细胞色素C氧化酶亚型5A(COX5A)，半乳糖凝集素-1(Gal-1)，过氧化物酶2(PRDX2)，过氧化物歧化酶(SODM)，3-羟酰辅酶A脱氢酶2(HCD2)，NADH脱氢酶(NDUS8)，且Western blot和RT-PCR对差别蛋白Trx1和PARK7的验证结果与2-DE结果一致。鉴定的差别蛋白主要参与细胞的氧化还原/氧化应激，线粒体相关功能，细胞凋亡、增殖与分化从及微管的调节等历程，其中氧化应激反应占据重要地位。（5）由Trx1介导的氧化应激通路探讨显示DBDCT干预细胞后，Trx1、DJ1、ASK1的蛋白表达和mRNA表达水平均升高， JNK和P38发生了蛋白磷酸化修饰，且呈现论文导读：
显著的时效与量效联系。N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)与DBDCT共同孵育细胞后，ROS表达水平显著下降，而细胞生存率上升，Trx1，DJ1蛋白的表达较DBDCT组降低，且JNK和P38的磷酸化水平也显著下降。其可能的意义机制为DBDCT诱导细胞自由基水平升高，使得Trx1蛋白表达升高从抵抗氧化应激意义，此时的Trx1逐渐失去了与ASK1的结合能力，使得ASK1游离；同时作为氧化应激的伴侣蛋白，DJ1也被激活并与死亡蛋白Daxx结合，进而抑制Daxx与ASK1的结合，使得游离的ASK1表达升高，激活MAPK通路中的JNK和P38，最终导致细胞凋亡与坏死。结论：（1）体内外探讨证明，DBDCT可引起显著的肝毒性。（2）氧化应激反应在毒性意义中占据重要地位，且主要通过升高胞内自由基水平，激活由Trx1介导的氧化应激通路来实现的。（3）抗氧化剂NAC可通过降低胞内ROS水平，进而影响Trx1介导的氧化应激通路从抵抗DBDCT引起的肝毒性。（4）Trx1蛋白可作为DBDCT引发肝毒性的早期监测指标。关键词：二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡（DBDCT）论文蛋白质组学论文氧化应激论文活性氧（ROS）论文硫氧还蛋白1(Trx1)论文N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)论文
本论文由www.7ctime.com,需要可从关系人员哦。中文摘要7-10
Abstract10-13
前言13-15
第一章 DBDCT 腹腔注射致大鼠肝脏毒性探讨15-38
第一节、DBDCT 腹腔注射致大鼠肝脏损伤模型的建立15-21
1、材料和仪器15-16
2、实验办法16-17
3、结果17-19
4、讨论19-21
第二节、DBDCT 腹腔注射致大鼠肝脏损伤的蛋白质组学探讨21-381、材料和仪器21-22
2、实验办法22-27
3、结果27-36
4、讨论36-38
第二章 DBDCT 致正常肝细胞 HL02 细胞毒性的意义机制探讨38-61第一节 DBDCT 对 HL02 细胞的毒性意义探讨38-48
1、材料和仪器38-39
2、实验办法39-41
3、结果41-46
4、讨论46-48
第二节 DBDCT 对 HL02 细胞的蛋白质组学探讨48-611、材料和仪器48-49
2、实验办法49-52
3、结果52-58
4、讨论58-61
第三章 DBDCT 对硫氧还蛋白 1（Trx1）介导的氧化应激意义机制的探讨61-73第一节 硫氧还蛋白 1（Trx1）介导的信号通路探讨61-67
1、材料和仪器61-62
2、实验办法62-63
3、结果63-66
4、讨论66-67
第二节 N-乙酰半胱氨酸（NAC）对氧化应激通路的影响67-731、材料和仪器67
2、实验办法67-68
3 结果68-714、讨论71-73
主要结论73-74参考文献74-83
英文缩略词83-85
综述85-97
参考文献92-97
攻读学位期间发表论文状况97-98
致谢98-99
个人介绍99-100