简谈激酶甘油激酶与核受体Nur77相互作用及其对肝脏脂代谢调控

论文导读：进行实时定量PCR实验，检测各基因在肝中mRNA水平表达情况。此外，将GK的CDS序列构建到pCDH慢病毒质粒中，并将有效干涉GK的siRNA序列构建到pSicoR慢病毒质粒中，293T细胞包装获得慢病毒，检测慢病毒滴度，并对GK慢病毒过表达/干涉效果进行检测。由免疫共沉淀实验证实GK与Nur77有着相互作用，GK的N端和C端是相互作用的结构域。GK使Nu
摘要：本课题前期探讨发现，GK与核孤儿受体Nur77有着蛋白质相互作用。近年探讨表明，Nur77和GK与肝脏脂代谢历程有着密切联系，提示GK与Nur77可能通过蛋白质相互作用对肝脏脂代谢进行调控。本论文对GK和Nur77相互作用进行深入探讨，揭示其对肝脏脂代谢调控功能的影响，为脂代谢调控和代谢类疾病的发病机制和治疗提供线索；同时为后续动物实验建立基础，构建了GK-pCDH过表达慢病毒和GK-pSicoR干涉慢病毒载体，获得稳定过表达/干涉GK的慢病毒。本论文首先利用免疫共沉淀技术，对GK与Nur77相互作用及作用域进行确认。进而利用Nur77对荧光素酶报告基因ApoA5promoter的转录激活作用，检测GK对Nur77的转录激活活性的影响。同时，选取几个受Nur77调控的脂代谢相关基因，在人肝细胞系L02及小鼠体内同时转染GK和Nur77的表达载体，进行实时定量PCR实验，检测各基因在肝中mRNA水平表达情况。此外，将GK的CDS序列构建到pCDH慢病毒质粒中，并将有效干涉GK的siRNA序列构建到pSicoR慢病毒质粒中，293T细胞包装获得慢病毒，检测慢病毒滴度，并对GK慢病毒过表达/干涉效果进行检测。由免疫共沉淀实验证实GK与Nur77有着相互作用，GK的N端和C端是相互作用的结构域。GK使Nur77报告基因转录活性降低，激活倍数可3倍降低至0.5倍，抑制效果显著，且不依赖于GK的激酶活性。Real-time PCR结果显示Nur77对Srebp-1c、Fas、Gpam和Acaca基因表达有抑制作用，经GK加入后可将表达由20%回转至90%。同时成功构建了GK过表达慢病毒载体GK-pCDH和GK干涉慢病毒载体GK-pSicoR，滴度分别达到7.8×10~6pfu/ml和2×10~7pfu/ml，GK蛋白过表达/干涉效果显著。上面陈述的探讨揭示了GK与Nur77的相互作用及其对肝脏脂代谢调控功能的影响，构建了GK慢病毒为后续实验建立基础。关键词：甘油激酶论文核孤儿受体论文Nur77论文脂代谢论文蛋白质相互作用论文
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ABSTRACT4-8
前言8-9
第一章 文献综述9-19

1.1 核孤儿受体 Nur77 及其 NR4A 家族9-13

1.1 概况9-10

1.2 NR4A 家族的调控10-11

1.3 NR4A 家族参与脂类的合成与分解代谢11-13

1.2 甘油激酶 GK 及其功能介绍13-16

1.2.1 甘油激酶 GK13-15

1.2.2 GK 参与人体脂类代谢的重要历程15-16

1.3 本课题探讨进展16-19

第二章 GK 抑制 Nur77 的转录活性19-43

2.1 材料与策略19-28

2.

1.1 质粒19

2.

1.2 细胞19

2.

1.3 动物19

2.

1.4 常用试剂及试剂盒19-20

2.

1.5 主要溶液配制20-21

2.

1.6 一般细胞培养条件21

2.

1.7 GK 激酶活性缺失体的构建21-22

2.

1.8 ApoA5-pGL3 报告基因载体构建22

2.

1.9 目的片段回收22

2.

1.10 酶切22

2.

1.11 连接22-23

2.

1.12 转化23

2.

1.13 菌落 PCR23

2.

1.14 质粒提取23-24

2.

1.15 细胞总蛋白提取24

2.

1.16 Western Blot24-25

2.

1.17 Co-IP25

2.

1.18 荧光素酶报告基因检测25-26

2.

1.19 细胞总 RNA 提取26-27

2.

1.20 小鼠体内转染27

2.

1.21 小鼠肝细胞总 RNA 提取27

2.

1.22 RT-PCR27

2.

1.23 Real-time RCR27-28

2.

1.24 统计学浅析28

2.2 结果与讨论28-42

2.1 GK 与 Nur77 的相互作用28-29

2.2 GK 与 Nur77 相互作用的结构域29-30

2.3 Nur77-GK 相互作用不依赖于 GK 活性30-33

2.4 GK 及 GK 截短体、突变体对 Nur77 转录激活的影响33-39

2.2.5 GK 上调脂代谢相关基因论文导读：常用试剂及试剂盒43-443.1.4主要溶液配制443.1.5GK慢病毒过表达载体的构建443.1.6GK慢病毒干涉载体的构建443.1.7慢病毒包装44-453.1.8流式细胞术测病毒滴度453.1.9慢病毒感染效果检测453.1.10统计学浅析45-463.2结果与讨论46-543.2.1GK慢病毒过表达载体的构建和包装46-493.2.2GK慢病毒干涉载体的构建和包装49
的转录39-42

2.3 小结42-43

第三章 GK 慢病毒系统构建及其在细胞内的运用43-55

3.1 材料与策略43-46

3.

1.1 质粒43

3.

1.2 细胞43

3.

1.3 常用试剂及试剂盒43-44

3.

1.4 主要溶液配制44

3.

1.5 GK 慢病毒过表达载体的构建44

3.

1.6 GK 慢病毒干涉载体的构建44

3.

1.7 慢病毒包装44-45

3.

1.8 流式细胞术测病毒滴度45

3.

1.9 慢病毒感染效果检测45

3.

1.10 统计学浅析45-46

3.2 结果与讨论46-54
3.

2.1 GK 慢病毒过表达载体的构建和包装46-49

3.

2.2 GK 慢病毒干涉载体的构建和包装49-52

3.

2.3 干涉 GK 对 Nur77 调控的脂代谢相关基因转录影响52-54

3.3 小结54-55
第四章 总结和展望55-56

4.1 总结55

4.2 展望55-56

附录56-58
参考文献58-62
发表论文和参加科研情况说明62-63
致谢63